Este protocolo é usado para estudar as qualidades de transporte de junções apertadas. Usando potenciais de diluição, você pode medir a permeseletividade e obter uma compreensão de junções apertadas em um tecido. Esta técnica é específica e utiliza tecidos nativos para estudos funcionais de epithelia.
Além disso, essa técnica mede as propriedades fisiológicas em tempo real de um tecido, o que é muito útil. O maior desafio é a preparação de tecidos. Praticar a técnica, além de assistir a este vídeo vai ajudar.
para confirmar a viabilidade tecidual também é um passo importante. Para começar, coloque os segmentos desejados de tecido intestinal coletados de camundongos claudin-15 em bolhas geladas da solução de Ringer e corte a gordura e tecido conjuntivo. Depois de cortar a gordura e o tecido conjuntivo, corte ao longo dos acessórios mesentéricos para abrir cada segmento longitudinalmente, em seguida, devolva os segmentos para a solução de Ringer frio de gelo e lave as peças completamente.
Para retirar a camada muscular, despeje de dois a três mililitros de gelo fresco e borbulhando a solução de Ringer em uma placa de dissecção coberta de borracha de silicone sob um microscópio de dissecção e use os pinos para fixar as extremidades de um segmento de tecido intestinal no prato com o lado mucosal voltado para baixo. Usando fórceps finos, disseca sem rodeios a camada muscular da mucosa subjacente, tomando cuidado para não rasgar ou introduzir quaisquer orifícios no tecido. Uma vez que a camada muscular tenha sido removida, corte um pedaço grande o suficiente para uma abertura de cinco milímetros de diâmetro e coloque o tecido em um pedaço de papel filtro perfurado de cinco milímetros molhado com o lado mucosal solução ringer para baixo usando um fundo preto para garantir que a abertura no papel filtro esteja completamente coberta pelo tecido sem rugas.
Para montar as preparações intestinais em uma câmara de Ussing, primeiro remova qualquer solução da câmara antes de dissimá-la. Coloque o papel filtro com o lado mucosal de preparação intestinal para baixo na câmara lateral mucosa usando as marcas pretas para alinhar a janela da câmara com o orifício no papel do filtro. Conecte cuidadosamente a câmara lateral serosal à câmara lateral mucosa sem mover a folha intestinal.
Reabastecer rapidamente ambas as câmaras com o tampão HEPES e coloque as borbulhantes na extremidade oposta de cada câmara longe da membrana. Reconecte as pontes de sal e verifique se a tensão está estável e, em seguida, pulso a corrente para garantir que as conexões estejam bem antes de permitir que o sistema se equilibre por cerca de 15 minutos. Para realizar um experimento potencial de diluição, primeiro lave ambos os lados da câmara com cinco mililitros de tampão HEPES pré-aquecido fresco por lado.
Ligue o sistema de gravação e defina o alcance para 250 milvolts. Defina as posições do marcador, defina o sistema de gravação para medir e ajuste os sistemas de câmara de Ussing para o modo de fixação. Uma vez estabilizado o potencial de medição, use os dados para medições.
Substitua rapidamente o tampão HEPES do lado mucosal da câmara por cinco mililitros de tampão HEPES de diluição aquecida complementado com cloreto de sódio de 75 milimilas. Uma vez que o potencial da membrana tenha atingido o pico, substitua o tampão de diluição do lado mucosal por um novo buffer HEPES. Para garantir que o tecido seja viável, adicione 10 micromolar Forskolin ao lado seroso.
Uma vez que a diferença potencial da membrana atingiu um pico e está começando a diminuir, o experimento acabou. Para medir a condutância elétrica transepitelial e a corrente de curto-circuito da linha de base, depois de lavar ambos os lados da câmara como demonstrado, adicione cinco mililitros de solução de Ringer bolha fresca para cada lado e defina o alcance do sistema de gravação para 2,5 volts. Defina as posições do marcador, defina o sistema de gravação para medir e ajuste o sistema de câmara de Ussing para o modo de fixação.
Uma vez estabilizada a corrente de curto circuito e a condutura, use os dados para medições de linha de base. Para garantir que o tecido seja viável, adicione Forskolin ao lado serosal como demonstrado. Uma vez que a diferença potencial da membrana atingiu um pico e começou a diminuir, o experimento acabou.
Nesta análise representativa, a condutância transmucosal de base do segmento intestinal médio pequeno foi menor nos camundongos claudin-15 em condições de curto-circuito em comparação com a observada em camundongos do tipo selvagem, enquanto a corrente de curto-circuito da linha de base foi maior. Após a diluição do cloreto de sódio luminal, observou-se uma diferença potencial positiva em relação ao lado sorosal em camundongos do tipo selvagem, mas a diferença foi diminuída nos camundongos eliminados claudin-15. Da mesma forma, a permeabilidade relativa do cloreto de sódio também foi diminuída nos animais de nocaute.
O cálculo das permeabilidades absolutas revelou que a permeabilidade absoluta do sódio diminuiu nos camundongos claudin-15, enquanto a permeabilidade absoluta do cloreto não, sugerindo que a diminuição da permeabilidade relativa deve-se à diminuição da permeabilidade do sódio. Como esperado, a adição de Forskolin ao lado serosal da câmara não causou uma diferença significativa na mudança da corrente de curto-circuito entre o nocaute e ratos do tipo selvagem. Uma vez que os segmentos intestinais demonstraram uma resposta grande o suficiente à Forskolin, as preparações da membrana foram consideradas viáveis.
É importante realizar a remoção adequada da camada muscular e garantir que o tecido seja viável. Por favor, enxágue a seção de dissecção dos camundongos se a preparação é viável.
