通过Ussing Chamber技术评估天然组织中肠道紧密连接屏障和离子渗透性的功能评估

该协议用于研究紧密连接的传输质量。使用稀释电位，您可以测量渗透选择性并了解组织中的紧密连接。该技术具有特异性，并使用天然组织进行上皮的功能研究。

此外，该技术测量组织的实时生理特性，这非常有用。最大的挑战是组织制备。练习这项技术，以及观看这个视频会有所帮助。

确认组织活力也是一个重要步骤。首先，将从claudin-15敲除小鼠收集的所需肠组织片段放入冰冷的气泡Ringer溶液中，并修剪掉脂肪和结缔组织。修剪掉脂肪和结缔组织后，沿着肠系膜附件切割以纵向打开每个节段，然后将节段返回冰冷的Ringer溶液并彻底清洗碎片。

要剥离肌肉层，在解剖显微镜下将两到三毫升新鲜冰冷的气泡Ringer溶液倒入硅橡胶覆盖的解剖板中，并使用销钉固定培养皿中一个肠组织段的末端，粘膜侧朝下。使用细镊子，从下面的粘膜上钝地解剖肌肉层，注意不要撕裂或将任何孔引入组织。一旦肌肉层被移除，切下一块足够大的五毫米直径开口，并将组织放在一块五毫米的打孔滤纸上，用Ringer溶液粘膜面朝下湿润，使用黑色背景，以确保滤纸中的开口完全被组织覆盖而没有皱纹。

要将肠道制剂安装在Ussing室中，首先要从腔室中取出任何溶液，然后再将其分解。使用黑色标记将带有肠道制备粘膜的滤纸面朝下放在粘膜侧室上，以使腔室窗口与滤纸上的孔对齐。小心地将浆膜侧室连接到粘膜侧室，而不移动肠片。

用HEPES缓冲液快速重新填充两个腔室，并将鼓泡液放置在远离膜的每个腔室的另一端。重新连接盐桥并检查电压是否稳定，然后脉冲电流以确保连接正常，然后让系统平衡约15分钟。要进行稀释电位实验，首先用每侧五毫升新鲜预热的HEPES缓冲液洗涤腔室的两侧。

打开记录系统并将范围设置为 250 毫伏。设置标记位置，设置要测量的记录系统，并将 Ussing 腔室系统设置为夹紧模式。一旦测量电位稳定下来，使用数据进行测量。

快速将腔室粘膜侧的HEPES缓冲液替换为5毫升加热稀释的HEPES缓冲液，并补充75毫摩尔氯化钠。一旦膜电位达到峰值，用新鲜的HEPES缓冲液替换粘膜侧的稀释缓冲液。为了确保组织是可行的，在血清侧添加10微摩尔毛喉素。

一旦膜电位差达到峰值并开始下降，实验就结束了。为了测量经上皮电导和基线短路电流，在如图所示清洗腔室两侧后，向每侧添加5毫升新鲜气泡的Ringer溶液，并将记录系统的范围设置为2.5伏。设置标记位置，设置要测量的记录系统，并将 Ussing 腔室系统设置为夹紧模式。

一旦短路电流和电导稳定下来，使用数据进行基线测量。为了确保组织是可行的，如所示，将毛喉素添加到血清侧。一旦膜电位差达到峰值并开始下降，实验就结束了。

在该代表性分析中，与野生型小鼠相比，短路条件下claudin-15敲除小鼠中小肠段的基线经粘膜电导率较低，而基线短路电流较高。在腔内氯化钠稀释后，在野生型小鼠中观察到血清侧的正电位差异，但在claudin-15敲除小鼠中差异降低。同样，氯化钠在敲除动物中的相对渗透性也降低了。

绝对渗透率的计算表明，克劳丁-15敲除小鼠钠的绝对渗透率降低，而氯化物的绝对渗透率没有降低，这表明相对渗透性的降低是由于钠的渗透性降低。正如预期的那样，将毛喉素添加到腔室的血清侧不会导致敲除和野生型小鼠之间短路电流变化的显着差异。由于肠段对毛喉素表现出足够大的反应，因此膜制剂被认为是可行的。

重要的是要进行适当的肌肉层去除并确保组织是可行的。请冲洗小鼠的解剖部分，该制剂是否可行。