Dieses Protokoll wird verwendet, um die Transportqualitäten von Tight Junctions zu untersuchen. Mit Hilfe von Verdünnungspotentialen können Sie die Permselektivität messen und ein Verständnis für Tight Junctions in einem Gewebe erhalten. Diese Technik ist spezifisch und verwendet natives Gewebe für funktionelle Studien von Epithelien.
Darüber hinaus misst diese Technik die physiologischen Eigenschaften eines Gewebes in Echtzeit, was sehr nützlich ist. Die größte Herausforderung ist die Gewebepräparation. Das Üben der Technik sowie das Ansehen dieses Videos helfen.
Die Bestätigung der Lebensfähigkeit des Gewebes ist ebenfalls ein wichtiger Schritt. Legen Sie zunächst die gewünschten Segmente des Darmgewebes, die von Claudin-15-Knockout-Mäusen gesammelt wurden, in eiskalte, gesprudelte Ringer-Lösung und schneiden Sie Fett und Bindegewebe ab. Nachdem Sie das Fett und das Bindegewebe entfernt haben, schneiden Sie entlang der mesenterialen Anhänge, um jedes Segment in Längsrichtung zu öffnen, dann bringen Sie die Segmente in die eiskalte Ringerlösung zurück und waschen Sie die Stücke gründlich.
Um die Muskelschicht abzustreifen, gießen Sie zwei bis drei Milliliter frische, eiskalte, sprudelnde Ringer-Lösung unter einem Dissektionsmikroskop in eine mit Silikonkautschuk bedeckte Dissektionsplatte und verwenden Sie die Stifte, um die Enden eines Darmgewebesegments in der Schale mit der Schleimhautseite nach unten zu sichern. Verwenden Sie eine feine Pinzette, sezieren Sie die Muskelschicht stumpf von der darunter liegenden Schleimhaut und achten Sie darauf, keine Löcher in das Gewebe zu reißen oder einzuführen. Sobald die Muskelschicht entfernt wurde, schneiden Sie ein Stück, das groß genug für eine Öffnung mit einem Durchmesser von fünf Millimetern ist, und legen Sie das Gewebe auf ein Stück fünf Millimeter gestanztes Filterpapier, das mit Ringers Lösungsschleimhautseite nach unten nass ist, wobei ein schwarzer Hintergrund verwendet wird, um sicherzustellen, dass die Öffnung im Filterpapier vollständig vom Gewebe ohne Falten bedeckt ist.
Um die Darmpräparate in einer Ussing-Kammer zu montieren, entfernen Sie zuerst die Lösung aus der Kammer, bevor Sie sie zerlegen. Legen Sie das Filterpapier mit der Darmvorbereitungsschleimhautseite nach unten auf die Schleimhautnebenkammer mit den schwarzen Markierungen, um das Kammerfenster mit dem Loch im Filterpapier auszurichten. Verbinden Sie die serosale Seitenkammer vorsichtig mit der Schleimhautseitenkammer, ohne das Darmblatt zu bewegen.
Füllen Sie beide Kammern schnell mit dem HEPES-Puffer auf und platzieren Sie sprudelnde Kammern am gegenüberliegenden Ende jeder Kammer abseits der Membran. Schließen Sie die Salzbrücken wieder an und überprüfen Sie, ob die Spannung stabil ist, und pulsieren Sie dann den Strom, um sicherzustellen, dass die Verbindungen in Ordnung sind, bevor Sie das System etwa 15 Minuten lang ausgleichen lassen. Um ein Verdünnungspotentialexperiment durchzuführen, waschen Sie zunächst beide Seiten der Kammer mit fünf Millilitern frischem vorgewärmtem HEPES-Puffer pro Seite.
Schalten Sie das Aufnahmesystem ein und stellen Sie den Bereich auf 250 Millivolt ein. Stellen Sie die Markerpositionen ein, stellen Sie das Aufnahmesystem auf Maß ein und stellen Sie die Ussing-Kammersysteme auf den Klemmmodus ein. Sobald sich das Messpotential stabilisiert hat, verwenden Sie die Daten für Messungen.
Ersetzen Sie den HEPES-Puffer schnell von der Schleimhautseite der Kammer durch fünf Milliliter erwärmten Verdünnungs-HEPES-Puffer, ergänzt durch 75-millimolares Natriumchlorid. Sobald das Membranpotential seinen Höhepunkt erreicht hat, ersetzen Sie den Verdünnungspuffer von der Schleimhautseite durch frischen HEPES-Puffer. Um sicherzustellen, dass das Gewebe lebensfähig ist, fügen Sie 10 mikromolare Forskolin auf die serosale Seite hinzu.
Sobald die Membranpotentialdifferenz einen Höhepunkt erreicht hat und zu sinken beginnt, ist das Experiment vorbei. Um die transepitheliale elektrische Leitfähigkeit und den Basiskurzschlussstrom zu messen, fügen Sie nach dem Waschen beider Seiten der Kammer wie gezeigt fünf Milliliter frische geblasene Ringer-Lösung auf jede Seite und stellen Sie den Bereich des Aufzeichnungssystems auf 2,5 Volt ein. Stellen Sie die Markerpositionen ein, stellen Sie das Aufnahmesystem auf Maß ein und stellen Sie das Ussing-Kammersystem auf den Klemmmodus ein.
Sobald sich der Kurzschlussstrom und der Leitwert stabilisiert haben, verwenden Sie die Daten für Basismessungen. Um sicherzustellen, dass das Gewebe lebensfähig ist, fügen Sie Forskolin wie gezeigt auf die serosale Seite hinzu. Sobald die Membranpotentialdifferenz einen Höhepunkt erreicht hat und zu sinken begonnen hat, ist das Experiment vorbei.
In dieser repräsentativen Analyse war der transmuköse Ausgangsleitwert des mittleren Dünndarmsegments bei den Claudin-15-Knockout-Mäusen unter Kurzschlussbedingungen niedriger als bei Wildtyp-Mäusen, während der Basiskurzschlussstrom höher war. Bei luminaler Natriumchlorid-Verdünnung wurde bei Wildtyp-Mäusen eine positive Potentialdifferenz in Bezug auf die serosale Seite beobachtet, aber die Differenz wurde bei den Claudin-15-Knockout-Mäusen verringert. In ähnlicher Weise war die relative Permeabilität von Natriumchlorid auch bei den Knockout-Tieren verringert.
Die Berechnung der absoluten Permeabilität ergab, dass die absolute Permeabilität von Natrium bei den Claudin-15-Knockout-Mäusen abnahm, während die absolute Permeabilität von Chlorid dies nicht tat, was darauf hindeutet, dass die Abnahme der relativen Permeabilität auf eine Abnahme der Natriumpermeabilität zurückzuführen ist. Wie erwartet, verursachte die Zugabe von Forskolin auf der serosalen Seite der Kammer keinen signifikanten Unterschied in der Änderung des Kurzschlussstroms zwischen den Knockout- und Wildtyp-Mäusen. Da die Darmsegmente eine ausreichend große Reaktion auf Forskolin zeigten, wurden die Membranpräparate als lebensfähig angesehen.
Es ist wichtig, eine angemessene Entfernung der Muskelschicht durchzuführen und sicherzustellen, dass das Gewebe lebensfähig ist. Bitte spülen Sie den Dissektionsabschnitt der Mäuse aus, ob das Präparat lebensfähig ist.
