بهدف التحقيق في سلامة الحاجز المعوي ، طورنا طريقة لقياس سلامة الحاجز المعوي في الماوس الأعضاء المعوية الصغيرة. في المقابل، نشير إلى استخدام ثقافة الخلية الأحادية، ويستند لدينا مقايسة على الأعضاء الأمعاء الصغيرة ثلاثية الأبعاد. كان تكييف مقايسة ثنائية الأبعاد لنموذجنا ضروريًا لـه للتطبيق العملي.
ويستند الفحص على organoids مثقف في المختبر وتطبيقه سوف تساعد على تحديد المستحثات ومثبطات سلامة الحاجز المعوي. تنظيم البروتينات ملتقى ضيق هو سمة هامة من جميع الخلايا الظهارية. لدينا فحص تمكن من وظيفة وتحليل سلامة الحاجز الظهارية.
لقياس سلامة حاجز organoids معزولة عن أنسجة الأمعاء الماوس، أولا معطف جميع أنابيب الطرد المركزي التي سيتم استخدامها لتخزين organoids أثناء عملية الطلاء مع ما يكفي من 0.1٪ BSA في برنامج تلفزيوني لتغطية جميع الأسطح البلاستيكية. إزالة حل فورا BSA ووضع الأنابيب على الجليد. بعد ذلك ، ذوبان حل مصفوفة الخلية والثقافة العضوية المتوسطة على الجليد وإزالة بعناية المتوسطة الثقافة من كل بئر من 48 جيدا لوحة الثقافة organoid.
غسل كل جيدا مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة قبل الأنابيب بقوة لإذابة مصفوفات الخلية. عندما تم الحصول على تعليق الخلية متجانسة نسبيا، وغسل organoids مع برنامج تلفزيوني جديد مرتين عن طريق الطرد المركزي و resuspend كل ثقافة الجهاز في 40 ميكرولترات من الوسط البارد. افصل الهياكل العضوية الكبيرة من خلال 10 ميكرولتر ماص تلميح خمس مرات لجمع الهياكل مع حجم 40 إلى 60 ميكرومتر وخلط كل تعليق organoid مع 40 ميكرولترات من حل مصفوفة الخلية الطازجة المعدة.
إضافة كل تعليق حل مصفوفة الخلايا العضوية في وسط الآبار الفردية من ثمانية أغطية غرف جيدة ووضع الشريحة على الجليد لمدة خمس دقائق. في نهاية الحضانة، ضع الشريحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 دقيقة لتمكين البلمرة من هيكل مصفوفة الخلايا العضوية قبل إضافة 150 ميكرولترات من الثقافة العضوية المتوسطة لكل بئر لمدة 24 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية. في نهاية الحضانة، علاج آبار التحكم الإيجابية مع 10 نانوغرام لكل ملليلتر من مورين المؤتلف إنترفيرون غاما لمدة 48 ساعة.
لإجراء فحص نفاذية، نقل غطاء الغرف إلى غرفة الحضانة الدافئة 37 درجة مئوية من مجهر مقلوب و تعيين ثاني أكسيد الكربون للغرفة إلى 5٪ قفل الغطاء بإحكام على مرحلة المجهر وضبط إعدادات التصوير من المجهر لتصور organoids في بئر واحدة من الغرفة. ثم، إضافة ثلاثة microliters من إعداد حديثا 100 ملليمولار لوسيفر الأصفر في 150 ميكرولترات من المتوسط إلى بئر واحد لمدة ساعة واحدة الحضانة في غرفة المجهر. في نهاية الحضانة، وضبط التركيز لتصور التجويف من organoid المرجعية وتحديد الطاقة الليزرية المطلوبة لإثارة لوسيفر الصفراء والحساسية الكشف عن كل من الصك لصورة إشارة لوسيفر الصفراء في 30 إلى 40٪ من النطاق الديناميكي المتاح من الصك.
بدلاً من ذلك، يمكن تعديل كثافة الإشارة عن طريق تغيير وقت التعرض. للعثور على مواقف حوالي 10 أعضاء مع هيكل كروي قريب من سطح الغطاء في البئر عن طريق التداخل التفاضلي التباين التصوير الحي ، والتقاط organoids مع أقطار مماثلة والتركيز على شريحة مركزية من organoids لتصوير التجويف. سجل التباين التداخل التفاضلي وفلورسينسي أصفر لوسيفر من كل موقف لتوثيق الشكل والسيارات الفلورية من كل organoid.
عندما تم تصوير جميع organoids ، إضافة 150 ميكرولترات من المتوسط ، بما في ذلك لوسيفر الصفراء ، إلى لوسيفر آبار العلاج الأصفر وصورة كل من الآبار كل خمس دقائق لمدة 70 دقيقة. في نهاية جلسة التصوير، إضافة أربعة ميكرولترات من EGTA أعدت حديثا إلى 100 ميكرولترات من المتوسط. أضف EGTA المخفف إلى الآبار المناسبة.
ثم، تسجيل الفلوريس من organoids في كل بئر كل خمس دقائق لمدة 30 دقيقة. تأكد من ممارسة التعامل مع وثقافة أو organoids مقدما كما البقاء الخلوية والنزاهة هي شرط أساسي لنجاح الفحص. في هذه التجربة التمثيلية ، بعد 70 دقيقة من العلاج مع لوسيفر الصفراء داخل الأضواء الصفراء كان واضحًا فقط في العضية من الحيوانات من النوع البري المعالجة بـ Interferon gamma.
لم تظهر الضوابط غير المنشطة، ولا organoids المستمدة من مستقبلات غاما-2 خروج المغلوب intraluminal لوسيفر الفلورسي الأصفر في نهاية فترة العلاج. تسبب إضافة EGTA في انهيار غير محدد لسلامة الحاجز المعوي عن طريق عزل العوامل المشتركة الضيقة ، مما أدى إلى تناول لوسيفر الأصفر والتعبير في جميع الأعضاء بغض النظر عن المنشأ أو ظروف العلاج. ويمكن أيضاً تحديد قيم الكثافة النسبية لمستوى الفلوري الأصفر لوسيفر داخل التجويف العضوي وخارج كل عضو.
تأكد من تحديد organoids مع حجم مماثل حول التكوين وتحديد محور مجموعة بحيث يمكنك أن تتخيل التجويف المركزي من organoid. بالإضافة إلى استخدام المواد التي تؤدي إلى انهيار الحاجز المعوي، يمكننا أيضًا تحري استراتيجيات تثبيط تدمير الحاجز المعوي. وبما أن هذه المنهجية تستند إلى خلايا أولية من واحد، فإنه يمكن استخدامها للعديد من المقايسات، مما يقلل من عدد الحيوانات المطلوبة لكل تجربة.
