Ce protocole est utilisé pour étudier les qualités de transport des jonctions serrées. En utilisant des potentiels de dilution, vous pouvez mesurer la permsélectivité et comprendre les jonctions serrées dans un tissu. Cette technique est spécifique et utilise des tissus natifs pour les études fonctionnelles de l’épithélium.
De plus, cette technique mesure les propriétés physiologiques en temps réel d’un tissu, ce qui est très utile. Le plus grand défi est la préparation des tissus. Pratiquer la technique, ainsi que regarder cette vidéo vous aidera.
confirmer la viabilité des tissus est également une étape importante. Pour commencer, placez les segments souhaités de tissu intestinal prélevés sur des souris knock-out claudin-15 dans la solution de Ringer à bulles glacées et coupez la graisse et le tissu conjonctif. Après avoir coupé la graisse et le tissu conjonctif, coupez le long des attaches mésentériques pour ouvrir chaque segment longitudinalement, puis retournez les segments à la solution glacée de Ringer et lavez soigneusement les morceaux.
Pour décaper la couche musculaire, versez deux à trois millilitres de solution de Ringer fraîchement glacée dans une plaque de dissection recouverte de caoutchouc de silicone sous un microscope à dissection et utilisez les broches pour fixer les extrémités d’un segment de tissu intestinal dans le plat avec le côté muqueux vers le bas. À l’aide de pinces fines, disséquez carrément la couche musculaire de la muqueuse sous-jacente, en prenant soin de ne pas déchirer ou introduire de trous dans le tissu. Une fois la couche musculaire enlevée, coupez un morceau assez grand pour une ouverture de cinq millimètres de diamètre et placez le tissu sur un morceau de papier filtre perforé de cinq millimètres mouillé avec la solution de Ringer côté muqueuse vers le bas en utilisant un fond noir pour vous assurer que l’ouverture dans le papier filtre est complètement recouverte par le tissu sans rides.
Pour monter les préparations intestinales dans une chambre d’Ussing, retirez d’abord toute solution de la chambre avant de la disséminer. Posez le papier filtre avec le côté muqueux de la préparation intestinale vers le bas sur la chambre latérale de la muqueuse en utilisant les marques noires pour aligner la fenêtre de la chambre avec le trou dans le papier filtre. Reliez soigneusement la chambre latérale séreuse à la chambre latérale muqueuse sans déplacer le drap intestinal.
Remplissez rapidement les deux chambres avec le tampon HEPES et placez celles qui bouillonnent à l’extrémité opposée de chaque chambre, loin de la membrane. Reconnectez les ponts de sel et vérifiez si la tension est stable, puis pulsez le courant pour vous assurer que les connexions sont correctes avant de permettre au système de s’équilibrer pendant environ 15 minutes. Pour effectuer une expérience de potentiel de dilution, lavez d’abord les deux côtés de la chambre avec cinq millilitres de tampon HEPES préchauffé frais par côté.
Allumez le système d’enregistrement et réglez la plage sur 250 millivolts. Réglez les positions des marqueurs, réglez le système d’enregistrement sur la mesure et réglez les systèmes de chambre Ussing en mode pince. Une fois que le potentiel de mesure s’est stabilisé, utilisez les données pour les mesures.
Remplacez rapidement le tampon HEPES du côté muqueux de la chambre par cinq millilitres de tampon HEPES de dilution réchauffé complété par du chlorure de sodium de 75 millimolaires. Une fois que le potentiel membranaire a atteint son apogée, remplacez le tampon de dilution du côté muqueux par un tampon HEPES frais. Pour vous assurer que le tissu est viable, ajoutez 10 forskoline micromolaires au côté séreux.
Une fois que la différence de potentiel membranaire a atteint un pic et commence à diminuer, l’expérience est terminée. Pour mesurer la conductance électrique transépithéliale et le courant de court-circuit de base, après avoir lavé les deux côtés de la chambre comme démontré, ajoutez cinq millilitres de solution de Ringer fraîchement bullenée de chaque côté et réglez la portée du système d’enregistrement à 2,5 volts. Réglez les positions des marqueurs, réglez le système d’enregistrement sur mesure et réglez le système de chambre Ussing en mode pince.
Une fois que le courant de court-circuit et la conductance se sont stabilisés, utilisez les données pour les mesures de base. Pour s’assurer que le tissu est viable, ajoutez la forskoline au côté séreux comme démontré. Une fois que la différence de potentiel membranaire a atteint un pic et a commencé à diminuer, l’expérience est terminée.
Dans cette analyse représentative, la conductance transmuqueuse de base du segment moyen de l’intestin grêle était plus faible chez les souris knock-out claudin-15 dans des conditions de court-circuit par rapport à celle observée chez les souris de type sauvage, tandis que le courant de court-circuit de base était plus élevé. Lors de la dilution luminale du chlorure de sodium, une différence de potentiel positive par rapport au côté séreux a été observée chez les souris de type sauvage, mais la différence a diminué chez les souris knock-out claudin-15. De même, la perméabilité relative du chlorure de sodium a également diminué chez les animaux knock-out.
Le calcul des perméabilités absolues a révélé que la perméabilité absolue du sodium diminuait chez les souris knock-out claudin-15, alors que la perméabilité absolue du chlorure ne diminuait pas, ce qui suggère que la diminution de la perméabilité relative est due à une diminution de la perméabilité du sodium. Comme prévu, l’ajout de forskoline au côté séreux de la chambre n’a pas causé de différence significative dans le changement de courant de court-circuit entre les souris knock-out et les souris de type sauvage. Étant donné que les segments intestinaux ont démontré une réponse suffisamment importante à la forskoline, les préparations membranaires ont été considérées comme viables.
Il est important d’effectuer l’enlèvement approprié de la couche musculaire et de s’assurer que les tissus sont viables. Veuillez rincer la section de dissection des souris si la préparation est viable.
