OCT هو عامل حفظ بالتبريد لا يتوافق مع تحليل قياس الطيف الكتلي. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين إزالة OCT من الأنسجة وتحديد كمية sphingolipids باستخدام مطياف الكتلة اللوني السائل جنبا إلى جنب. سيتم عرض تحضير فتائل تجفيف الأنسجة وغسل الأنسجة ووزن الأنسجة بواسطة أبريل بويد من جامعة فرجينيا كومنولث ، وسيتم عرض استخراج الدهون من قبل الدكتور جيريمي أليجود ، مدير مركز فرجينيا كومنولث الأيض والدهون الأساسية.
للبدء ، قم بتنظيف المقص الجراحي عن طريق غمره في الميثانول لمدة خمس دقائق ، متبوعا بمسحه بنسيج نظيف من الدرجة المختبرية. باستخدام قفازات خالية من البودرة ، قم بتدوير نهاية نسيج من الدرجة المختبرية لإنشاء فتيل مدبب بدقة بطول 30 إلى 40 ملم. ثم باستخدام مقص تنظيف الميثانول ، وقطع الفتيل في النهاية السميكة ووضعه في صندوق من الورق المقوى النظيف.
بعد ذلك ، باستخدام مقص الميثانول المنظف ، قم بقطع أربعة إلى خمسة ملليمترات من طرف ماصة ملليلتر واحد ووضع الطرف مرة أخرى في حامل الطرف. لغسل OCT من الأنسجة ، أضف 10 ملليلتر من الماء المنزوع الأيونات عالي النقاء إلى كل أنبوب يحتوي على أنسجة الرئة البشرية وقم بتغطيتها بإحكام. اسمح للأنابيب بالحضانة لمدة 10 دقائق.
دوامة بقوة كل أنبوب حتى يتم إعادة إحياء جميع الأنسجة المودعة على جدران الأنبوب أو بيليه الأنسجة بالكامل. ثم قم بالطرد المركزي للأنابيب في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح مبرد مسبقا عند 4،000 إلى 5،000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، قم بفك الأنابيب الموجودة على الجليد.
استنشاق محلول الغسيل بعناية ، وترك ما يقرب من 0.5 ملليلتر من المادة الطافية في الأنبوب ، ثم قم بتغليف الأنبوب. بعد إزالة المادة الطافية من جميع الأنابيب ، اغسل الأنسجة مرتين أخريين بنفس الطريقة. بعد غسل إزالة OCT الثلاثة ، استخدم طرف الماصة المختصر المحضر لإضافة 500 ميكرولتر من PBS المثلج البارد إلى الأنبوب.
باستخدام نفس الطرف ، أعد تعليق الحبيبات برفق وانقل جميع الأنسجة المعاد تعليقها إلى أنبوب طرد مركزي 1.5 ملليلتر ملصقة مسبقا ووزنها مسبقا. احتفظ بالأنبوب على الثلج حتى يتم نقل جميع عينات الأنسجة. قم بتكوير الأنسجة عن طريق طرد الأنابيب بالطرد المركزي في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا ، ثم استنشاق أكبر قدر ممكن من PBS بعناية دون إزعاج الحبيبات ووضع الأنابيب مرة أخرى على الجليد.
باستخدام فتائل تجفيف الأنسجة المعدة مسبقا ، قم بإزالة أي محلول غسيل متبقي برفق ، ثم أغلق الأنبوب وضعه على الثلج. لوزن الأنابيب ، ضع أنبوبا واحدا في كل مرة في ميزان تحليلي تمت معايرته مؤخرا وصفر وأغلق باب الغرفة. بمجرد استقرار الوزن ، قم بتسجيله في جدول بيانات إلكتروني.
بعد الوزن ، ضع الأنبوب مرة أخرى على الثلج وأضف 300 ميكرولتر من PBS البارد الجليد. باستخدام طرف ماصة مختصر ، انقل جميع الأنسجة بعناية إلى مليلتر من الميثانول البارد المثلج في أنبوب زجاجي لولبي مذكور مسبقا. قبل استخراج الدهون ، اسمح للأنسجة ومعايير قياس الطيف الكتلي الداخلية للدهون بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ، ثم دوامة وغمر المحاليل القياسية الداخلية في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية حتى تذوب معايير الدهون تماما.
باستخدام ماصة متكررة ، أضف 250 بيكومول من معايير قياس الطيف الكتلي الداخلي لكل أنبوب وقم بتلخيص الأنابيب برفق. لتسهيل التجانس ، اضبط حجم الميثانول على ملليلتر ، ثم سحن الأنسجة باستخدام الخالط عن طريق تحريك طرف الخالط بحركة دائرية مضغوطة برفق على جدار الأنبوب. عندما لا تكون الكتل مرئية ، قم بتلخيص الأنبوب.
اغمر الأنبوب بزاوية 45 درجة في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية لمدة 5 إلى 10 ثوان. ثم تحت غطاء الدخان ، أضف الكلوروفورم والميثانول إلى كل أنبوب لتحقيق نسبة الميثانول إلى الكلوروفورم إلى الماء من اثنين إلى واحد إلى 0.1. أغلق الأنابيب بإحكام واتركها على الطاولة حتى نهاية اليوم.
قبل مغادرة ذلك المساء ، ضع الأنابيب المغطاة بإحكام في حمام مائي 48 درجة مئوية لحضانة ليلية. في اليوم التالي, بيليه أي مذيب وحطام قابل للذوبان عن طريق الطرد المركزي. ثم في غطاء الدخان ، قم بصب المادة الطافية بعناية في أنابيب اختبار زجاجية من البورسليكات 13 إلى 100 ملم مائلة بزاوية 30 إلى 45 درجة لتسهيل الصب.
بعد صب المادة الطافية من جميع الأنابيب ، استخدم مكثف فراغ بأقصى تفريغ مع خطوة تسخين أولية مدتها ساعة واحدة عند 40 درجة مئوية لتبخير كل المذيبات ، ثم أضف 500 ميكرولتر من الميثانول إلى كل أنبوب. لإعادة تعليق مستخلصات الدهون المجففة ، دوامة الأنبوب لمدة 5 إلى 10 ثوان ، ثم اغمر الأنبوب في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية بزاوية 45 درجة مع الدوران لمدة دقيقتين. أعد دوامة الأنبوب لمدة خمس ثوان وأعد الانغماس في حمام الماء بالموجات فوق الصوتية لمدة دقيقة إضافية.
قم بإزالة أي حطام غير قابل للذوبان عن طريق الطرد المركزي ، ثم صب المادة الطافية في قارورة حاقن ذاتي موسومة مسبقا مائلة بزاوية 30 إلى 45 درجة لتسهيل الصب. قم بتغطية القوارير بإحكام قبل تخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى التحليل. يؤكد تحليل مطياف الكتلة الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة بالتأين بالرش الكهربائي بعد إزالة OCT أن الأنواع المختلفة ذات طول السلسلة من السيراميد والسيراميد أحادي الهكسوسيل مرتفعة بشكل ملحوظ في أورام الورم الغدي الرئوي البشري مقارنة بالأنسجة الطبيعية المجاورة غير المعنية.
تتلاشى معايير Sphingolipid بالتتابع بالترتيب التالي: d17: 1 سفينغوزين ، d17: 1 سفينغوسين -1-فوسفات ، C12 لاكتوسيل سيراميد ، C12 أحادي هكسوسيل سيراميد ، C12 سفينغوميلين ، وسيراميد C12. لكل نوع من أنواع sphingolipid هذه ، باستخدام إعدادات التدرج والأجهزة في النص ، هناك تحول إيجابي تقريبي 0.15 دقيقة في وقت الاحتفاظ لكل زيادة كربونية في طول السلسلة. ومع ذلك ، قد يكون للدهون ذات طول السلسلة الأطول مثل C24 و C26 تحولات زمنية أكبر للاحتفاظ.
علاوة على ذلك ، غالبا ما تؤدي الرابطة المزدوجة في الأحماض الدهنية إلى تحول سلبي لمدة 0.15 دقيقة في وقت الاحتفاظ. وبالتالي ، سيكون للسيراميد C18: 1 وقت احتفاظ مشابه لسيراميد C16. بدلا من الاعتماد بشكل حصري تقريبا على الأنسجة التي تم جمعها حديثا ، يوسع هذا البروتوكول مصادر الأنسجة التي يمكن استخدامها لتحليل قياس الطيف الكتلي لتشمل تلك المخزنة بالتبريد في المستودعات الحيوية.
