用于质谱分析的最佳切割温度化合物中嵌入的人组织制备

OCT是一种冷冻保存剂，与质谱分析不相容。使用该协议，研究人员可以从组织中去除OCT，并使用串联液相色谱质谱法定量鞘脂。组织干燥灯芯的制备，组织清洗和组织称重将由弗吉尼亚联邦大学的April Boyd演示，脂质提取将由弗吉尼亚联邦代谢组学和脂质组学核心主任Jeremy Allegood博士演示。

首先，将手术剪刀浸入甲醇中五分钟，然后用干净的实验室级纸巾擦拭，以清洁手术剪刀。使用无粉手套，旋转实验室级纸巾的末端，形成 30 至 40 毫米长的细锥形灯芯。然后使用甲醇清洁的剪刀，在厚端剪下灯芯并将其放入干净的纸板箱中。

接下来，使用甲醇清洁的剪刀，从一毫升移液器吸头的尖端切下四到五毫米，然后将吸头放回吸头支架中。为了洗去组织中的OCT，向每个装有人肺组织的管中加入10毫升冰冷的超纯去离子水，并盖紧它们。让试管孵育 10 分钟。

剧烈涡旋每个管，直到沉积在管壁或组织沉淀上的所有组织完全重悬。然后将试管在预冷的摆动桶离心机中以4， 000至5， 000倍G离心10分钟，温度为4摄氏度。离心完成后，在冰上打开试管的盖子。

小心地吸出洗涤溶液，在管中留下约0.5毫升的上清液，然后重新盖上管。从所有管中取出上清液后，以相同的方式再洗涤组织两次。在三次OCT去除洗涤后，使用准备好的缩短移液器吸头向管中加入500微升冰冷的PBS。

使用相同的尖端，轻轻重悬沉淀，并将所有重悬的组织转移到预先标记并预先称重的1.5毫升离心管中。将试管放在冰上，直到转移所有组织样本。通过在预冷离心机中离心管来沉淀组织，然后在不干扰沉淀的情况下小心地吸出尽可能多的PBS，并将管放回冰上。

使用之前准备好的纸巾干燥芯，轻轻除去任何剩余的洗涤溶液，然后关闭试管并将其放在冰上。要称量试管，请将一个试管一次放入最近校准的去皮和归零分析天平中，然后关闭腔室门。体重稳定后，将其记录在电子电子表格中。

称重后，将试管放回冰上，加入 300 微升冰冷的 PBS。使用缩短的移液器吸头，小心地将所有组织转移到预先标记的螺旋盖玻璃管中的两毫升冰冷甲醇中。在脂质提取之前，让组织和质谱内部脂质标准品平衡至室温20分钟，然后涡旋并将内标溶液浸入超声水浴中，直到脂质标准品完全溶解。

使用重复移液器，向每个试管中加入250皮摩尔的内部质谱标准品，并轻轻盖上试管。为了便于均质化，将甲醇的体积调节至两毫升，然后使用均质器通过以圆周运动移动均质器尖端轻轻压在管壁上来研磨组织。当团块不再可见时，重新盖上试管。

将管子以 45 度角浸入超声波水浴中 5 到 10 秒。然后在通风橱下，向每个试管中加入氯仿和甲醇，使甲醇与氯仿与水的比例为二比一至0.1。将试管密封紧，并将它们放在工作台上，直到一天结束。

在当晚离开之前，将密盖的试管放入48摄氏度的水浴中孵育过夜。第二天，通过离心沉淀任何溶剂和可溶性碎片。然后在通风橱中，小心地将上清液倒入预先标记的13中，放入100毫米硼硅酸盐玻璃试管中，以30至45度角倾斜以方便倾析。

从所有试管中倾析上清液后，使用最大真空的真空浓缩器，在40摄氏度下进行初始一小时的加热步骤以蒸发所有溶剂，然后向每个试管中加入500微升甲醇。要重悬干燥的脂质提取物，请涡旋管5至10秒，然后将试管以45度角旋转浸入超声波水浴中两分钟。重新涡旋管子五秒钟，然后重新浸入超声波水浴中一分钟。

通过离心除去任何不溶性碎屑，然后将上清液倒入预先标记的自动进样器小瓶中，倾斜30至45度角，以方便倾析。在将小瓶储存在零下80摄氏度直至分析之前，请盖紧小瓶。去除OCT后的液相色谱电喷雾串联质谱分析证实，与正常的相邻未受累组织相比，人肺腺癌肿瘤中各种链长的神经酰胺和单己糖神经酰胺显着升高。

鞘脂标准品按以下顺序依次洗脱：d17：1 鞘氨醇、d17：1 鞘氨醇-1-磷酸、C12 乳糖神经酰胺、C12 单己糖基神经酰胺、C12 鞘磷脂和 C12 神经酰胺。对于这些鞘脂种类中的每一种，使用文本中的梯度和仪器设置，链长每增加两次碳，保留时间就会发生大约正 0.15 分钟的偏移。然而，较长的链长脂质（如C24和C26）可能具有较大的保留时间偏移。

此外，脂肪酸中的双键通常会导致保留时间发生负0.15分钟的偏移。因此，C18：1神经酰胺的保留时间与C16神经酰胺相似。该协议不是几乎完全依赖于新鲜收集的组织，而是扩展了可用于质谱分析的组织来源，以包括那些低温存储在生物储存库中的组织来源。