OCT는 질량 분석과 호환되지 않는 저온 보존제입니다. 이 프로토콜을 사용하여 연구원들은 조직에서 OCT를 제거하고 탠덤 액체 크로마토그래피 질량분석법으로 스핑고지질을 정량화할 수 있습니다. 조직 건조 심지, 조직 세척 및 조직 칭량의 준비는 버지니아 커먼 웰스 대학의 April Boyd가 시연하고 지질 추출은 버지니아 커먼 웰스 대사체학 및 지질체학 코어의 책임자 인 Jeremy Allegood 박사가 시연합니다.
시작하려면 수술 용 가위를 메탄올에 5 분 동안 담가 닦은 다음 깨끗한 실험실 등급 티슈로 닦으십시오. 파우더가 없는 장갑을 사용하여 실험실 등급 티슈의 끝을 빙글빙글 돌려 30-40mm 길이의 미세하게 가늘어진 심지를 만듭니다. 그런 다음 메탄올로 청소 한 가위를 사용하여 두꺼운 끝 부분의 심지를 자르고 깨끗한 판지 상자에 넣으십시오.
다음으로, 메탄올 세척 가위를 사용하여 1 밀리리터 피펫 팁의 끝에서 4-5 밀리미터를 자르고 팁을 팁 홀더에 다시 놓습니다. 조직에서 OCT를 씻어 내려면 인간의 폐 조직이 들어있는 각 튜브에 얼음처럼 차가운 초순수 탈 이온수 10 밀리리터를 넣고 단단히 덮으십시오. 튜브를 10 분 동안 배양하십시오.
튜브 또는 조직 펠릿의 벽에 침착된 모든 조직이 완전히 재부유될 때까지 각 튜브를 격렬하게 소용돌이합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 10 분 동안 4, 000에서 5, 000 배 G에서 사전 냉각 된 스윙 버킷 원심 분리기에서 튜브를 원심 분리합니다. 원심분리가 완료되면 얼음 위의 튜브의 뚜껑을 풉니다.
세척 용액을 조심스럽게 흡인하여 튜브에 약 0.5 밀리리터의 상청액을 남긴 다음 튜브를 다시 덮습니다. 모든 튜브에서 상청액을 제거한 후 동일한 방법으로 조직을 두 번 더 씻으십시오. 세 번의 OCT 제거 세척 후 준비된 단축 피펫 팁을 사용하여 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS를 튜브에 추가합니다.
동일한 팁을 사용하여 펠릿을 부드럽게 재현탁하고 재현 된 모든 조직을 사전 라벨링되고 사전 무게가 측정 된 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 모든 조직 샘플이 옮겨 질 때까지 튜브를 얼음 위에 두십시오. 사전 냉각된 원심분리기에서 튜브를 원심분리하여 조직을 펠릿화한 다음 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 PBS를 조심스럽게 흡입하고 튜브를 다시 얼음 위에 놓습니다.
앞서 준비한 티슈 건조 심지를 사용하여 남아 있는 세척액을 부드럽게 제거한 다음 튜브를 닫고 얼음 위에 놓습니다. 튜브를 칭량하려면 최근에 보정된 타르 및 영점 분석 저울에 한 번에 하나의 튜브를 놓고 챔버 도어를 닫습니다. 무게가 안정되면 전자 스프레드 시트에 기록하십시오.
칭량 후 튜브를 얼음 위에 다시 놓고 300마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS를 추가합니다. 단축 된 피펫 팁을 사용하여 모든 조직을 미리 라벨이 붙은 스크류 탑 유리 튜브에 2 밀리리터의 얼음처럼 차가운 메탄올로 조심스럽게 옮깁니다. 지질 추출 전에 조직 및 질량 분석법 내부 지질 표준물이 20분 동안 실온과 평형을 이루도록 한 다음 지질 표준물이 완전히 용해될 때까지 내부 표준 용액을 초음파 수조에 와동시키고 담그십시오.
반복 피펫을 사용하여 내부 질량 분석 표준물질의 피코몰 250개를 각 튜브에 추가하고 튜브를 가볍게 다시 닫습니다. 균질화를 용이하게하기 위해, 메탄올의 부피를 2 밀리리터로 조정 한 다음, 튜브 벽에 부드럽게 눌려진 원형 운동으로 균질 기 팁을 움직여 균질 기를 사용하여 조직을 분쇄한다. 덩어리가 더 이상 보이지 않으면 튜브를 다시 덮으십시오.
튜브를 초음파 수조에 45도 각도로 5-10 초 동안 담그십시오. 그런 다음 흄 후드 아래에서 각 튜브에 클로로포름과 메탄올을 추가하여 메탄올 대 클로로포름 대 물 비율이 2 대 1 대 0.1입니다. 튜브를 단단히 밀봉하고 하루가 끝날 때까지 벤치 탑에 두십시오.
그날 저녁 떠나기 전에 단단히 덮인 튜브를 섭씨 48도의 수조에 넣어 밤새 배양합니다. 다음날, 원심분리를 통해 용매와 용해성 파편을 펠릿화합니다. 그런 다음 흄 후드에서 상청액을 미리 라벨링된 13으로 조심스럽게 디캔팅하여 디캔팅을 용이하게 하기 위해 30-45도 각도로 기울어진 100mm 붕규산 유리 시험관으로 기울입니다.
모든 튜브에서 상청액을 디캔팅한 후 섭씨 40도에서 초기 1시간 가열 단계와 함께 최대 진공에서 진공 농축기를 사용하여 모든 용매를 증발시킨 다음 각 튜브에 500마이크로리터의 메탄올을 추가합니다. 건조된 지질 추출물을 재현탁하려면 튜브를 5-10초 동안 와동시킨 다음 튜브를 45도 각도로 초음파 수조에 2분 동안 회전시킵니다. 튜브를 5 초 동안 다시 소용돌이 치고 초음파 수조에 1 분 더 담그십시오.
원심분리에 의해 임의의 불용성 파편을 제거하고, 디캔팅을 용이하게 하기 위해 30 내지 45도 각도로 기울어진 사전 라벨링된 자동주입기 바이알에 상청액을 디캔팅한다. 분석될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하기 전에 바이알을 단단히 덮으십시오. OCT 제거 후 액체 크로마토 그래피 전기 분무 이온화 탠덤 질량 분석법 분석은 다양한 사슬 길이의 세라마이드 및 모노 헥 소실-세라마이드가 정상적인 인접 비 관련 조직에 비해 인간 폐 선암 종양에서 유의하게 상승한다는 것을 확인합니다.
스핑고지질 표준물질은 d17:1 스핑고신, d17:1 스핑고신-1-포스페이트, C12 락토실-세라마이드, C12 모노헥소실-세라마이드, C12 스핑고미엘린 및 C12 세라마이드의 순서로 순차적으로 용리됩니다. 이러한 스핑고지질 종 각각에 대해 텍스트의 기울기 및 계측 설정을 사용하면 사슬 길이가 두 번 증가할 때마다 머무름 시간이 대략 0.15분 정도 이동합니다. 그러나 C24 및 C26과 같은 더 긴 사슬 길이의 지질은 머무름 시간 이동이 더 클 수 있습니다.
또한, 지방산의 이중 결합은 종종 머무름 시간의 음의 0.15 분 변화를 초래합니다. 따라서 C18:1 세라마이드는 C16 세라마이드와 유사한 머무름 시간을 갖습니다. 이 프로토콜은 거의 독점적으로 새로 수집된 조직에 의존하는 대신 질량 분석에 사용할 수 있는 조직 소스를 확장하여 생물 저장소에 극저온으로 저장된 조직을 포함합니다.
