OCT, kütle spektrometrisi analizi ile uyumlu olmayan bir kriyo-koruma ajanıdır. Bu protokolü kullanarak, araştırmacılar OCT'yi dokulardan çıkarabilir ve tandem sıvı kromatografisi kütle spektrometresi ile sfengolipidleri ölçebilirler. Doku kurutma fitillerinin hazırlanması, doku yıkama ve doku tartımı Virginia Commonwealth Üniversitesi'nden April Boyd tarafından gösterilecek ve lipit ekstraksiyonu Virginia Commonwealth Metabolomik ve Lipidomik Çekirdeği direktörü Dr. Jeremy Allegood tarafından gösterilecektir.
Başlamak için, cerrahi makası beş dakika boyunca metanole batırarak temizleyin, ardından temiz bir laboratuvar sınıfı doku ile silin. Pudrasız eldivenler kullanarak, ince konik 30 ila 40 milimetre uzunluğunda bir fitil oluşturmak için laboratuvar sınıfı bir dokunun ucunu döndürün. Daha sonra metanolü kullanarak makas temizlenir, fitili kalın ucundan kesin ve temiz bir karton kutuya yerleştirin.
Daha sonra, metanol temizlenmiş makası kullanarak, bir mililitrelik pipet ucunun ucundan dört ila beş milimetre kesin, ucu tekrar uç tutucuya yerleştirin. OCT'yi dokulardan temizlemek için, insan akciğer dokusunu içeren her tüpe 10 mililitre buz gibi soğuk ultra saf deiyonize su ekleyin ve sıkıca kapatın. Tüplerin 10 dakika boyunca inkübe olmasına izin verin.
Tüpün duvarlarında biriken tüm doku veya doku peleti tamamen yeniden askıya alınana kadar her tüpü kuvvetlice vorteksleyin. Daha sonra tüpleri önceden soğutulmuş sallanan bir kova santrifüjünde dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 4.000 ila 5.000 kez G'de santrifüj yapın. Santrifüjleme tamamlandıktan sonra, tüplerin kapağını buz üzerinde açın.
Yıkama çözeltisini dikkatlice aspire edin, tüpün içinde yaklaşık 0,5 mililitre süpernatant bırakın, ardından tüpü yeniden doldurun. Süpernatantı tüm tüplerden çıkardıktan sonra, dokuları aynı şekilde iki kez daha yıkayın. Üç OCT çıkarma yıkamasından sonra, tüpe 500 mikrolitre buz gibi soğuk PBS eklemek için hazırlanan kısaltılmış pipet ucunu kullanın.
Aynı ucu kullanarak, peleti nazikçe yeniden askıya alın ve yeniden askıya alınan tüm dokuyu önceden etiketlenmiş ve önceden tartılmış 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüm doku örnekleri transfer edilene kadar tüpü buz üzerinde tutun. Tüpleri önceden soğutulmuş bir santrifüjde santrifüj yaparak dokuları pelet edin, daha sonra peleti rahatsız etmeden PBS'nin mümkün olduğunca çoğunu dikkatlice aspire edin ve tüpleri tekrar buzun üzerine yerleştirin.
Daha önce hazırlanan doku kurutma fitillerini kullanarak, kalan yıkama solüsyonunu nazikçe çıkarın, ardından tüpü kapatın ve buzun üzerine yerleştirin. Tüpleri tartmak için, yakın zamanda kalibre edilmiş katranlı ve sıfırlanmış analitik teraziye her seferinde bir tüp yerleştirin ve hazne kapağını kapatın. Ağırlık stabilize edildikten sonra, elektronik bir elektronik tabloya kaydedin.
Tarttıktan sonra, tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin ve 300 mikrolitre buz gibi soğuk PBS ekleyin. Kısaltılmış bir pipet ucu kullanarak, tüm dokuyu önceden etiketlenmiş vidalı bir cam tüp içinde iki mililitre buz gibi soğuk metanole dikkatlice aktarın. Lipid ekstraksiyonundan önce, dokuların ve kütle spektrometrisi iç lipit standartlarının 20 dakika boyunca oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin, daha sonra vorteks yapın ve lipit standartları tamamen çözülene kadar iç standart çözeltileri ultrasonik bir su banyosuna daldırın.
Tekrarlanan bir pipet kullanarak, her tüpe dahili kütle spektrometresi standartlarında 250 pikomol ekleyin ve tüpleri hafifçe özetleyin. Homojenizasyonu kolaylaştırmak için, metanolün hacmini iki mililitreye ayarlayın, ardından homojenizatör ucunu tüp duvarına hafifçe bastırılmış dairesel bir hareketle hareket ettirerek bir homojenizatör kullanarak dokuyu tritürleştirin. Kümeler artık görünmediğinde, tüpü yeniden özetleyin.
Tüpü 45 derecelik bir açıyla ultrasonik bir su banyosunda 5 ila 10 saniye bekletin. Daha sonra bir duman başlığı altında, iki ila bir ila 0.1 arasında bir metanol ila kloroform su oranı elde etmek için her tüpe kloroform ve metanol ekleyin. Tüpleri sıkıca kapatın ve günün sonuna kadar tezgahın üzerinde bırakın.
O akşam ayrılmadan önce, sıkıca kapatılmış tüpleri bir gece inkübasyonu için 48 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin. Ertesi gün, santrifüjleme ile herhangi bir çözücü ve çözünür döküntüyü pelet edin. Daha sonra bir duman davlumbazında, süpernatantı dikkatlice 13 ila 100 milimetre borosilikat cam test tüplerine boşaltın ve dekantasyonu kolaylaştırmak için 30 ila 45 derecelik bir açıyla eğilin.
Süpernatantı tüm tüplerden boşalttıktan sonra, tüm çözücüyü buharlaştırmak için 40 santigrat derecede ilk bir saatlik ısıtma adımıyla maksimum vakumda bir vakum yoğunlaştırıcı kullanın, ardından her tüpe 500 mikrolitre metanol ekleyin. Kurutulmuş lipit ekstraktlarını yeniden askıya almak için, tüpü 5 ila 10 saniye boyunca vorteksleyin, ardından tüpü iki dakika boyunca rotasyonla 45 derecelik bir açıyla ultrasonik bir su banyosuna batırın. Tüpü beş saniye boyunca yeniden vorteksleyin ve bir dakika daha ultrasonik su banyosuna tekrar daldırın.
Çözünmeyen kalıntıları santrifüjleme ile temizleyin, ardından süpernatantı dekantasyonu kolaylaştırmak için 30 ila 45 derecelik bir açıyla eğilmiş önceden etiketlenmiş bir otomatik enjektör şişesine boşaltın. Şişeleri analize kadar eksi 80 santigrat derecede saklamadan önce sıkıca kapatın. OCT çıkarılmasını takiben sıvı kromatografisi elektrosprey iyonizasyon tandem kütle spektrometrisi analizi, insan akciğer adenokarsinom tümörlerinde normal bitişik tutulmamış dokulara kıyasla çeşitli zincir boyu seramidler ve monohekzosil-seramidlerin türlerinin önemli ölçüde yükseldiğini doğrulamaktadır.
Sfengolipid standartları aşağıdaki sırayla sırayla ortaya çıkar: d17: 1 sfengosin, d17: 1 sfengosin-1-fosfat, C12 laktosil-seramid, C12 monoheksosil-seramid, C12 sfingomiyelin ve C12 seramid. Bu sfengolipid türlerinin her biri için, metindeki gradyan ve enstrümantasyon ayarlarını kullanarak, zincir uzunluğundaki her iki karbon artışı için tutma süresinde yaklaşık pozitif 0.15 dakikalık bir kayma vardır. Bununla birlikte, C24 ve C26 gibi daha uzun zincir uzunluğundaki lipitler daha büyük tutma süresi kaymalarına sahip olabilir.
Ayrıca, yağ asidindeki bir çift bağ genellikle tutma süresinde negatif 0.15 dakikalık bir kaymaya neden olur. Böylece, C18: 1 seramid, C16 seramidine benzer bir tutma süresine sahip olacaktır. Neredeyse sadece taze toplanmış dokulara güvenmek yerine, bu protokol kütle spektrometrisi analizi için kullanılabilecek doku kaynaklarını, biyodepolarda kriyojenik olarak depolananları içerecek şekilde genişletir.
