ОКТ является криоконсерватором, несовместимым с масс-спектрометрическим анализом. Используя этот протокол, исследователи могут удалять ОКТ из тканей и количественно определять сфинголипиды с помощью тандемной жидкостной хроматографической масс-спектрометрии. Приготовление фитилей для сушки тканей, промывка тканей и взвешивание тканей будут продемонстрированы Эйприл Бойд из Университета Содружества Вирджинии, а экстракция липидов будет продемонстрирована доктором Джереми Аллегудом, директором Virginia Commonwealth Metabolomics and Lipidomics Core.
Для начала очистите хирургические ножницы, погрузив их в метанол на пять минут, а затем протрите их чистой тканью лабораторного класса. Используя перчатки без порошка, закрутите конец ткани лабораторного класса, чтобы создать тонко суженный фитиль длиной от 30 до 40 миллиметров. Затем с помощью метанола очистите ножницы, вырежьте фитиль на толстом конце и поместите его в чистую картонную коробку.
Затем, используя очищенные ножницы метанола, отрежьте от четырех до пяти миллиметров от кончика одного миллилитра пипетки и поместите наконечник обратно в держатель наконечника. Чтобы смыть ОКТ из тканей, добавьте 10 миллилитров ледяной холодной сверхчистой деионизированной воды в каждую трубку, содержащую легочную ткань человека, и плотно закройте их. Дайте пробиркам инкубироваться в течение 10 минут.
Энергично вращайте каждую трубку до тех пор, пока вся ткань, осажденная на стенках трубки или тканевая гранула, не будет полностью повторно суспендирована. Затем центрифугируйте трубки в предварительно охлажденную центрифугу с качающимся ведром при температуре от 4 000 до 5 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Как только центрифугирование будет завершено, снимите трубки на льду.
Осторожно аспирируйте промывочный раствор, оставляя примерно 0,5 миллилитра супернатанта в трубке, затем повторите трубку. После удаления супернатанта из всех трубок промыть ткани еще дважды таким же образом. После трех промывок удаления OCT используйте подготовленный укороченный наконечник пипетки, чтобы добавить 500 микролитров ледяного PBS в трубку.
Используя тот же наконечник, осторожно повторно суспендируйте гранулу и перенесите всю повторно суспендированную ткань в предварительно маркированную и предварительно взвешенную 1,5-миллилитровую центрифужную трубку. Держите трубку на льду до тех пор, пока не будут перенесены все образцы тканей. Гранулируйте ткани, центрифугируя трубки в предварительно охлажденной центрифуге, затем тщательно аспирируйте как можно больше PBS, не нарушая гранулу, и поместите трубки обратно на лед.
Используя фитили для сушки тканей, приготовленные ранее, аккуратно удалите оставшийся моющий раствор, затем закройте трубку и поместите ее на лед. Чтобы взвесить трубки, поместите по одной трубке за раз в недавно откалиброванные смоляные и обнуленные аналитические весы и закройте дверцу камеры. Как только вес стабилизируется, запишите его в электронную таблицу.
После взвешивания поместите трубку обратно на лед и добавьте 300 микролитров ледяного PBS. Используя укороченный наконечник пипетки, осторожно переложите всю ткань в два миллилитра ледяного холодного метанола в предварительно маркированную стеклянную трубку с винтовой крышкой. Перед извлечением липидов дайте тканям и масс-спектрометрии внутренние липидные стандарты уравновеситься до комнатной температуры в течение 20 минут, затем вихрь и погрузить внутренние стандартные растворы в ультразвуковую водяную баню до полного растворения липидных стандартов.
Используя повторяющуюся пипетку, добавьте 250 пикомолей внутренних стандартов масс-спектрометрии в каждую трубку и слегка подведите итоги трубок. Чтобы облегчить гомогенизацию, отрегулируйте объем метанола до двух миллилитров, затем тритурируйте ткань с помощью гомогенизатора, перемещая наконечник гомогенизатора круговыми движениями, мягко прижатыми к стенке трубки. Когда сгустки больше не видны, повторите трубку.
Погрузите трубку под углом 45 градусов в ультразвуковую водяную баню на 5-10 секунд. Затем под вытяжной капюшоном добавляют хлороформ и метанол в каждую трубку, чтобы достичь соотношения метанола к хлороформу к воде от двух к одному к 0,1. Плотно запечатайте трубки и оставьте их на столешнице до конца дня.
Перед отъездом вечером поместите плотно закрытые трубки в водяную баню с температурой 48 градусов по Цельсию для ночной инкубации. На следующий день гранулируют любой растворитель и растворимый мусор центрифугированием. Затем в вытяжном шкафу тщательно декантируйте супернатант в предварительно маркированные 13 в 100-миллиметровые боросиликатные стеклянные пробирки, наклоненные под углом от 30 до 45 градусов, чтобы облегчить декантирование.
После декантирования супернатанта из всех трубок используйте вакуумный концентратор при максимальном вакууме с начальной часовой стадией нагрева при 40 градусах Цельсия, чтобы испарить весь растворитель, затем добавьте 500 микролитров метанола в каждую трубку. Чтобы повторно суспендировать высушенные липидные экстракты, вращайте трубку в течение 5-10 секунд, затем погружайте трубку в ультразвуковую водяную баню под углом 45 градусов с вращением в течение двух минут. Повторно вихрь трубки в течение пяти секунд и повторно погружайтесь в ультразвуковую водяную баню еще на минуту.
Удалите любой нерастворимый мусор путем центрифугирования, затем декантируйте супернатант в предварительно маркированный флакон автоинжектора, наклоненный под углом от 30 до 45 градусов, чтобы облегчить декантирование. Плотно закройте флаконы, прежде чем хранить их при температуре минус 80 градусов по Цельсию до анализа. Анализ жидкостной хроматографии с электрораспылением ионизации тандемной масс-спектрометрии после удаления ОКТ подтверждает, что различные виды церамидов и моногексозил-керамидов длиной цепи значительно повышены в опухолях аденокарциномы легких человека по сравнению с нормальными соседними невовлеченными тканями.
Стандарты сфинголипидов элюируют последовательно в следующем порядке: d17:1 сфингозин, d17:1 сфингозин-1-фосфат, C12 лактозил-керамид, C12 моногексозил-керамид, C12 сфингомиелин и C12 керамид. Для каждого из этих видов сфинголипидов, используя настройки градиента и приборов в тексте, существует приблизительный положительный сдвиг времени удержания на 0,15 минуты на каждые два увеличения длины цепи углерода. Однако липиды более длинной цепи, такие как C24 и C26, могут иметь большие сдвиги времени удержания.
Кроме того, двойная связь в жирной кислоте часто приводит к отрицательному сдвигу времени удержания на 0,15 минуты. Таким образом, церамид C18:1 будет иметь время удержания, аналогичное церамиду C16. Вместо того, чтобы полагаться почти исключительно на свежесобранные ткани, этот протокол расширяет тканевые источники, которые могут быть использованы для масс-спектрометрического анализа, включая те, которые криогенно хранятся в биорепозиториях.
