L'OCT è un agente di crioconservazione incompatibile con l'analisi di spettrometria di massa. Utilizzando questo protocollo, i ricercatori possono rimuovere l'OCT dai tessuti e quantificare gli sfingolipidi con la spettrometria di massa per cromatografia liquida tandem. La preparazione degli stoppini per l'essiccazione dei tessuti, il lavaggio dei tessuti e la pesatura dei tessuti saranno dimostrati da April Boyd della Virginia Commonwealth University, e l'estrazione dei lipidi sarà dimostrata dal Dr.Jeremy Allegood, direttore del Virginia Commonwealth Metabolomics and Lipidomics Core.
Per iniziare, pulire le forbici chirurgiche immergendole nel metanolo per cinque minuti, seguite da pulirle con un tessuto pulito di laboratorio. Utilizzando guanti senza polvere, ruotare l'estremità di un tessuto di laboratorio per creare uno stoppino finemente affusolato lungo da 30 a 40 millimetri. Quindi usando le forbici pulite al metanolo, tagliare lo stoppino all'estremità spessa e metterlo in una scatola di cartone pulita.
Quindi, utilizzando le forbici pulite a metanolo, tagliare da quattro a cinque millimetri dalla punta di una punta di pipetta da un millilitro e riposizionare la punta nel supporto della punta. Per lavare via l'OCT dai tessuti, aggiungere 10 millilitri di acqua deionizzata ultrapura ghiacciata a ciascun tubo contenente tessuto polmonare umano e coprirli ermeticamente. Lasciare incubare i tubi per 10 minuti.
Vortice vigorosamente ogni tubo fino a quando tutto il tessuto depositato sulle pareti del tubo o del pellet di tessuto è completamente sospeso. Quindi centrifugare i tubi in una centrifuga a secchio oscillante pre-raffreddata a 4.000 a 5.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Una volta completata la centrifugazione, aprire i tubi sul ghiaccio.
Aspirare con cura la soluzione di lavaggio, lasciando circa 0,5 millilitri di surnatante nel tubo, quindi ricapitolare il tubo. Dopo aver rimosso il surnatante da tutti i tubi, lavare i tessuti altre due volte nello stesso modo. Dopo i tre lavaggi di rimozione OCT, utilizzare la punta della pipetta accorciata preparata per aggiungere 500 microlitri di PBS ghiacciato al tubo.
Utilizzando la stessa punta, risospendere delicatamente il pellet e trasferire tutto il tessuto risospeso in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri pre-etichettata e pre-pesata. Tenere il tubo sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni di tessuto sono trasferiti. Pellettare i tessuti centrifugando i tubi in una centrifuga pre-refrigerata, quindi aspirare con cura quanto più PBS possibile senza disturbare il pellet e riposizionare i tubi sul ghiaccio.
Utilizzando gli stoppini di asciugatura del tessuto preparati in precedenza, rimuovere delicatamente qualsiasi soluzione di lavaggio rimanente, quindi chiudere il tubo e posizionarlo sul ghiaccio. Per pesare i tubi, posizionare un tubo alla volta in una bilancia analitica tarata tarata e azzerata di recente e chiudere lo sportello della camera. Una volta che il peso si è stabilizzato, registralo in un foglio di calcolo elettronico.
Dopo la pesatura, riposizionare il tubo sul ghiaccio e aggiungere 300 microlitri di PBS ghiacciato. Utilizzando una punta di pipetta accorciata, trasferire con cura tutto il tessuto in due millilitri di metanolo ghiacciato in un tubo di vetro a vite preetichettato. Prima dell'estrazione dei lipidi, lasciare che i tessuti e gli standard lipidici interni della spettrometria di massa si equilibrino a temperatura ambiente per 20 minuti, quindi vortice e immergere le soluzioni standard interne in un bagno d'acqua ad ultrasuoni fino a quando gli standard lipidici non si sono completamente dissolti.
Utilizzando una pipetta a ripetizione, aggiungere 250 picomoli degli standard di spettrometria di massa interna a ciascun tubo e ricapitolare leggermente i tubi. Per facilitare l'omogeneizzazione, regolare il volume di metanolo a due millilitri, quindi triturare il tessuto utilizzando un omogeneizzatore spostando la punta dell'omogeneizzatore con un movimento circolare premuto delicatamente contro la parete del tubo. Quando i grumi non sono più visibili, richiudere il tubo.
Immergere il tubo con un angolo di 45 gradi in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 5-10 secondi. Quindi, sotto una cappa aspirante, aggiungere cloroformio e metanolo a ciascun tubo per ottenere un rapporto metanolo/cloroformio / acqua di due a uno a 0,1. Sigillare saldamente i tubi e lasciarli sul banco fino alla fine della giornata.
Prima di partire quella sera, posizionare i tubi strettamente coperti in un bagno d'acqua a 48 gradi Celsius per un'incubazione notturna. Il giorno seguente, pellettare eventuali solventi e detriti solubili mediante centrifugazione. Quindi, in una cappa aspirante, decantare accuratamente il surnatante in provette di vetro borosilicato pre-etichettate da 13 a 100 millimetri inclinate con un angolo da 30 a 45 gradi per facilitare la decantazione.
Dopo aver decantato il surnatante da tutti i tubi, utilizzare un concentratore di vuoto al massimo vuoto con una fase iniziale di riscaldamento di un'ora a 40 gradi Celsius per far evaporare tutto il solvente, quindi aggiungere 500 microlitri di metanolo a ciascun tubo. Per risospendere gli estratti lipidici essiccati, vortice il tubo per 5-10 secondi, quindi immergere il tubo in un bagno d'acqua ad ultrasuoni con un angolo di 45 gradi con rotazione per due minuti. Ri-vortice il tubo per cinque secondi e re-immergere nel bagno d'acqua ad ultrasuoni per un altro minuto.
Rimuovere eventuali detriti insolubili mediante centrifugazione, quindi decantare il surnatante in una fiala di autoiniettore pre-etichettata inclinata con un angolo da 30 a 45 gradi per facilitare la decantazione. Chiudere saldamente i flaconcini prima di conservarli a meno 80 gradi Celsius fino all'analisi. L'analisi della spettrometria di massa tandem a ionizzazione elettrospray per cromatografia liquida dopo la rimozione dell'OCT conferma che varie specie di ceramidi e monoesosil-ceramidi a lunghezza di catena sono significativamente elevate nei tumori dell'adenocarcinoma polmonare umano rispetto ai normali tessuti adiacenti non coinvolti.
Gli standard degli sfingolipidi eluiscono sequenzialmente nel seguente ordine: d17: 1 sfingosina, d17: 1 sfingosina-1-fosfato, C12 lattosil-ceramide, C12 monoesosil-ceramide, C12 sfingomielina e C12 ceramide. Per ciascuna di queste specie di sfingolipidi, utilizzando le impostazioni del gradiente e della strumentazione nel testo, c'è uno spostamento positivo approssimativo di 0,15 minuti nel tempo di ritenzione per ogni aumento di due atomi di carbonio nella lunghezza della catena. Tuttavia, i lipidi a catena più lunga come C24 e C26 possono avere spostamenti di tempo di ritenzione maggiori.
Inoltre, un doppio legame nell'acido grasso spesso si traduce in uno spostamento negativo di 0,15 minuti nel tempo di ritenzione. Pertanto, la ceramide C18: 1 avrà un tempo di ritenzione simile alla ceramide C16. Piuttosto che basarsi quasi esclusivamente su tessuti appena raccolti, questo protocollo espande le fonti di tessuto che possono essere utilizzate per l'analisi della spettrometria di massa per includere quelle criogenicamente conservate nei biorepository.
