على نطاق صغير بروتوكول عزل غشاء البلازما وmGFPHis علامة مزدوجة، وتوفير طريقة اقتصادية وسريعة وموثوق بها وسهلة لتوصيف البروتينات الغشاء في كائن نموذج eukaryotic، Saccharomyces cerevisiae. أكبر ميزة لهذه التكنولوجيا هي سهولة وسرعة التي يمكن تحديد مستويات التعبير عن البروتين الغشاء، وأنشطة ATP والمنظفات الأنسب لتنقيتها. هذه التكنولوجيا هي سهلة الاستعمال للغاية.
ومع ذلك، نقطة واحدة هامة أن نتذكر هو حصاد الخلايا كما OD 600 من 2، مما يضمن انخفاض التلوث الميتوكوندريا وأعلى أنشطة ATPase ممكن. تبدأ قبل زراعة مستعمرة خميرة واحدة في 10 ملليلتر من المتوسط YPD في 30 درجة مئوية لمدة سبع إلى ثماني ساعات في 200 تناوب في الدقيقة الواحدة. استخدام 10 ملليلتر من ثقافة ما قبل تلقيح 40 ملليلتر من المتوسطة YPD الطازجة.
ثم احتضان الخلايا في 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها في 200 دوران في الدقيقة الواحدة حتى تصل كثافة الخلية إلى OD 600 من واحد إلى ثلاثة. في اليوم التالي حصاد 40 وحدة الكثافة البصرية، أو ODU، من خلايا الوجه لوغاريتمي عن طريق الطرد المركزي في 4، 200 مرة G لكل خمس دقائق في أربع درجات مئوية. إعادة تعليق وغسل الخلايا مع 40 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج الجليد الباردة العقيمة.
كرر الغسيل باستخدام ملليلتر واحد من الماء البارد المثلج مع الطرد المركزي بين خطوات الغسيل. إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من الماء المثلج البارد العقيم ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي الصغيرة 1.5 ملليلتر تبريد مسبق على الجليد. حصاد الخلايا في 3، 300 مرة G لمدة ثلاث دقائق في أربع درجات مئوية.
أسبيرات supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في 500 ميكرولتر من العازلة المتجانسة تستكمل حديثا مع واحد ملليمولار فينال ميثيل sulfa نيل فلوريد، أو PMSF. تخزين تعليق الخلية في ناقص 80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام. إذابة الجليد الخلايا على الجليد لمدة ساعة تقريبا.
ثم أضف الجليد الباردة 0.5 ملليمتر قطرها حبات السيليكا إلى 500 ميكرولتر من تعليق الخلية للوصول إلى حجم إجمالي قدره ملليلتر واحد. لكسر الخلايا، دوامة تعليق الخلية في أقصى كثافة اهتزاز لمدة دقيقة واحدة، لمدة ست دورات، مع فترة تبريد ثلاث دقائق على الجليد بعد كل دورة. بعد الدوامة، قم بعمل ثقب رفيع في الجزء السفلي من الأنبوب مع شفرة مشرط ساخنة وجمع الخلايا المكسورة المتجانسة في أنبوب طرد مركزي آخر بارد 1.5 ملليلتر صغير مع دوران منخفض السرعة لمدة 10 ثوان.
الطرد المركزي تجانس الخلية التي تم جمعها في 5، 156 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية لإزالة حطام الخلية. نقل 450 ميكرولتر من supernatant في الجليد الباردة 1.5 ملليلتر أنبوب الطرد المركزي الدقيق وإضافة ملليلتر واحد من الجليد الباردة المتجانسة العازلة تكملها واحدة PMSF ملليمولار الطازجة. لحصاد أغشية البلازما الطرد المركزي تعليق الخلية في 17, 968 مرات G لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية.
إزالة supernatant وإضافة 100 ميكرولتر من العازلة التجانس تستكمل حديثا مع PMSF ملليمولار واحد. ثم تخفيف بيليه غشاء البلازما عن طريق تحريك مع تلميح ماصة 100 ميكرولتر وإعادة تعليق بيليه عن طريق تكرار pipetting صعودا وهبوطا. قياس تركيز البروتين لإعداد غشاء البلازما مع مجموعة من البروتين المقايسة التي تتوافق مع المخازن المؤقتة التي تحتوي على عامل الحد والمنظفات.
تخزين أغشية البلازما في ناقص 80 درجة مئوية، أو الاحتفاظ بها على الجليد للاستخدام الفوري. صب أربعة إلى خمسة ملليلتر من فصل هلام في جهاز هلام تجميعها تصل إلى سنتيمترين من الأعلى. طبقة بعناية 1-2 ملليلتر من 0.1٪ SDS على رأس والسماح للهلاميد بولي لتعيين لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد ساعة إزالة طبقة 0.1٪ SDS من هلام فصل البوليمر وشطف الجل مع الماء المقطر مزدوجة لإزالة آثار SDS. صب مزيج هلام التراص على هلام فصل. وضع مشط في هلام التراص وإزالة أي فقاعات الهواء من جميع أنحاء المشط.
ثم السماح للهلام التراص لتعيين لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة المشط ثم شطف فتحات هلام بالماء. وضع هلام في خزان هلام وملء خزان هلام إلى الأعلى مع تشغيل العازلة.
مزيج خمسة إلى 10 ميكرولتر من عينات غشاء البلازما مع كميات متساوية من اثنين من صبغة تحميل البروتين وتحميل على الفور خليط العينة في فتحات هلام الفردية، غارقة في تشغيل العازلة. تحميل البروتين علامات الوزن الجزيئي في نطاق من 10 إلى 245 كيلودالتون في فتحة منفصلة لتمكين تقدير حجم شظايا البروتين الفردية. أداء الكهربائي هلام في 200 فولت حتى صبغة التحميل الأزرق يصل إلى الجزء السفلي من هلام.
فحص الجل لفلورسينس GFP في هلام مع نظام التصوير هلام. بعد التصوير الفلوري إصلاح البروتينات في 10 إلى 20 ملليلتر من محلول تحديد هلام البروتين عن طريق التحريض لطيف من هلام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم شطف مرتين لمدة 10 دقائق مع 10 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج ووضع الجل في 10 ملليلتر من محلول وصمة عار كوماسي الغروية مع اهتزاز لطيف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لتصور عصابات البروتين.
لتحسين التصور من عصابات البروتين، دي وصمة عار الجل مرة أو مرتين في 20 ملليلتر من الماء المقطر مزدوجة لمدة ساعة واحدة قبل تسجيل الصور مع نظام التصوير هلام. تم تحقيق وتيرة عالية من التحول من Saccharomyces cerevisiae دلتا دلتا D مع PS2 plasmid التحكم الإيجابي. لم يتم الحصول على محولات يوروسيل بروتروترون للسيطرة السلبية.
تم الحصول على حوالي 50 URA الخلية prototroph CDR1-mGFPHis تحويل بعد احتضان خلايا دلتا دلتا AD تحولت على CSM ناقص لوحات URA لمدة ثلاثة أيام. تم القضاء على المحول الصغير الذي لا يمكن أن ينمو على لوحات أغار وحدات حماية الشعب. تم قياس عينات CDR1-mGHPHis بتركيزات متفاوتة كميا مع الفلورسينس داخل الجل.
كانت كثافة الفلورسينس mGFP خطية على مدى نطاق التركيز بأكمله مع الحد الأدنى من مضان الخلفية. وأشار اختلاف كثافة الخلية إلى أن كسر 40 وحدة من الخلايا أسفر عن أعلى جودة من أغشية البلازما مع أعلى نشاط CDR1 ATPase. ومع ذلك ، فإن غلة أغشية البلازما زادت بما يتناسب مع زيادة كثافات الخلايا.
تم اختبار قدرة 31 المنظفات مع خصائص مختلفة لslubilize CDR1-mGHPHis من أغشية البلازما الخام من دلتا دلتا AD، خلايا CDR1-mGHPHis مع صفحة SDS. بيتا وألفا DDM وفوس الكولين 13 كانت أفضل المنظفات لsolubilize CDR1-mGHPHis. ومع ذلك, فوس الكولين 13 يسبب التحلل المائي الجزئي من CDR1-mGHPHis.
تم فصل بروتين غشاء البلازما الخام solubilized مع 1٪ المنظفات باستخدام superos ستة زيادة 10 300 GL حجم العمود الاستبعاد. وأظهرت الكروماتوجرامات من Maltosides وLMNG استخراج البروتينات معظم CDR1-mGHPHis التملص كذروة غاوسية على شكل جيد في 15.5 ملليمتر CDR1-mGHPHis solubilized مع الجلوكوز التي تحتوي على المنظفات ألمح كذروة مجمعة أو واسعة مجمعة. وأشارت القمم الأعلى ل DDM إلى أن جزءا كبيرا من DMN G solubilized CDR1-mGHPHis قد يتم تشويهه.
في الكروماتوجرامات FSCC لzwitterionic فوس الكولين واثنين من المنظفات غير الأيونية فقط Digitonin وأعطى كروماتوغرام مماثلة لDDM. أعطى فوس الكولين 13 ذروة حادة على شكل متناظرة ، لكنه ألمح مع حجم elution أقل بكثير من ذلك لDDM. كما أن العلامة المزدوجة المحسنة تحسن غلة التنقية وساعدت في تحديد توطين بروتينات الأغشية والاتجار بها واستقرارها الحراري.
يمكن أيضا استخدام تقنية التعبير heterologous في فحص الأدوية عالية الإنتاجية ، والتوصيف التفصيلي للعديد من بروتينات الأغشية الأخرى.
