Küçük ölçekli plazma membran izolasyon protokolü ve mGFPHis çift etiket, ökaryotik model organizma saccharomyces cerevisiae membran proteinlerini karakterize etmek için ekonomik, hızlı, güvenilir ve kolay bir yöntem sağlar. Bu teknolojinin en büyük avantajı, membran protein ekspresyon seviyelerinin, ATP'nin faaliyetlerinin ve deterjanın saflaştırılması için en uygun olduğu kolaylık ve hızdır. Bu teknoloji çok kullanıcı dostudur.
Bununla birlikte, hatırlanması gereken önemli bir nokta, hücreleri düşük mitokondriyal kontaminasyon ve mümkün olan en yüksek ATPase aktivitelerini sağlayan 2'nin OD 600'ü olarak hasat etmektir. Dakikada 200 dönüşte yedi ila sekiz saat boyunca 30 santigrat derecede 10 mililitre YPD ortamında tek bir maya kolonisini önceden kült ederek başlayın. 40 mililitre taze YPD ortamını aşılamak için 10 mililitre ön kültür kullanın.
Daha sonra hücre yoğunluğu bir ila üç arasında bir OD 600'e ulaşana kadar hücreleri dakikada 200 dönüşte bir gecede 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, dört santigrat derecede beş dakikada 4.200 kez G'de santrifüjleme yaparak logaritmik yüz hücrelerinin 40 optik yoğunluk birimini veya ODU'yu hasat edin. Hücreleri 40 mililitre buz gibi steril çift damıtılmış su ile yeniden askıya alın ve yıkayın.
Yıkama adımları arasında santrifüjleme ile bir mililitre buzlu soğuk su kullanarak yıkamayı tekrarlayın. Peletin bir mililitre buz gibi steril suda yeniden askıya alınması ve hücre süspansiyonunun buz üzerinde önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarılması. Hücreleri 3,300 kez G'de dört santigrat derecede üç dakika boyunca hasat edin.
Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini bir milimoler fenal metil sülfa Neal florür veya PMSF ile taze olarak desteklenmiş 500 mikrolitre homojenize tamponda yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonu, daha fazla kullanıma kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Buzdaki hücreleri yaklaşık bir saat buzda çözün.
Daha sonra toplam bir mililitre hacme ulaşmak için hücre süspansiyonunun 500 mikrolitresine buz gibi 0,5 milimetre çapında silika boncukları ekleyin. Hücreleri kırmak için, hücre süspansiyonu bir dakika boyunca maksimum sallama şiddetinde, altı döngü boyunca, her döngüyü takip eden buz üzerinde üç dakikalık bir soğutma süresi ile girdap. Girdaplamadan sonra, ısıtmalı neşter bıçağı ile tüpün dibinde ince bir delik açın ve kırık hücre homojenliğini 10 saniye boyunca düşük hızlı dönüş ile başka bir buz gibi 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpüne toplayın.
Toplanan hücre homojenliğini 5,156 kez G'de 4 santigrat derecede beş dakika boyunca hücre kalıntılarını gidermek için santrifüjleyin. 450 mikrolitre süpernatantı buz gibi 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpüne aktarın ve bir milimolar taze PMSF ile desteklenmiş bir mililitre buz soğuk homojenizatif tampon ekleyin. Plazma membranlarını toplamak için hücre süspansiyonu 17, 968 kez G'de dört santigrat derecede bir saat boyunca santrifüj.
Süpernatantı çıkarın ve bir milimolar PMSF ile taze olarak desteklenmiş 100 mikrolitre homojenizatif tampon ekleyin. Daha sonra 100 mikroliter pipet ucu ile karıştırarak plazma membran peletini gevşetin ve pipetleme tekrarlayarak peletin tekrar tekrar askıya alın. Plazma membran preparatının protein konsantrasyonunu, azaltıcı madde ve deterjan içeren tamponlarla uyumlu bir protein test kiti ile ölçün.
Plazma zarlarını eksi 80 santigrat derecede saklayın veya hemen kullanım için buzda tutun. Birleştirilmiş jel aparatına üstten iki santimetreye kadar dört ila beş mililitre ayırma jeli dökün. Üzerine bir ila iki mililitre %0,1 SDS'yi dikkatlice katlayın ve poli akrilamid jelin oda sıcaklığında 60 dakika ayarlamasına izin verin.
Bir saat sonra% 0.1 SDS tabakasını polimerize ayırma jelinden çıkarın ve SDS izlerini gidermek için jeli çift damıtılmış su ile durulayın. İstifleme jeli karışımını ayırma jelinin üzerine dökün. İstifleme jeline bir tarak yerleştirin ve tarağın etrafındaki hava kabarcıklarını çıkarın.
Daha sonra istifleme jelinin oda sıcaklığında 60 dakika ayarlamasına izin verin. Tarağı çıkarın ve jel yuvalarını suyla durulayın. Jeli jel tankına koyun ve jel tankını çalışan tamponla üste doldurun.
Beş ila 10 mikrolitre plazma membran numunesini iki kat protein yükleme boyası eşit hacimde karıştırın ve numune karışımını hemen çalışan tampona batırılmış bireysel jel yuvalarına yükleyin. 10 ila 245 Kilodalton aralığındaki protein moleküler ağırlık belirteçlerini ayrı bir yuvaya yükleyerek tek tek protein parçalarının boyut tahminini sağlayın. Mavi yükleme boyası jelin dibine ulaşana kadar 200 voltta jel elektroforezi gerçekleştirin.
Jel görüntüleme sistemi ile jel içi GFP floresan için jeli inceleyin. Floresan görüntülemeyi takiben, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca jelin hafif ajitasyonu ile 10 ila 20 mililitre protein jel sabitleme çözeltisinde proteinleri sabitleyin. Daha sonra iki kez 10 mililitre çift damıtılmış su ile 10 dakika durulayın ve protein bantlarını görselleştirmek için oda sıcaklığında bir saat hafifçe sallanarak jeli 10 mililitre kolloidal Kumasi leke çözeltisine yerleştirin.
Protein bantlarının daha iyi görselleştirilmesi için, jel görüntüleme sistemiyle görüntü kaydetmeden önce bir saat boyunca 20 mililitre çift damıtılmış suda jeli bir veya iki kez lekeden arındırın. Pozitif kontrol plazmid PS2 ile Saccharomyces cerevisiae A D Delta Delta'nın yüksek bir dönüşüm sıklığı elde edildi. Negatif kontrol için Eurocell Prototron transformantları elde edildi.
CSM eksi URA plakalarında üç gün boyunca dönüştürülmüş AD Delta delta hücrelerinin inkübasyonundan sonra yaklaşık 50 URA hücre prototroph CDR1-mGFPHis transformant elde edildi. YPG agar plakalarında yetişemeyen minyon transformant ortadan kaldırıldı. Cdr1-mGHPHis örnekleri çeşitli konsantrasyonlarda jel floresan ile ölçülmektedir.
mGFP floresan yoğunlukları, minimum arka plan floresan ile tüm konsantrasyon aralığında doğrusaldı. Hücre yoğunluğunun değişmesi, 40 ODU hücrenin kırılmasının en yüksek CDR1 ATPase aktivitesi ile en yüksek kalitede plazma zarı sağladığını gösterdi. Bununla birlikte, plazma zarlarının verimi artan hücre yoğunlukları ile orantılı olarak artmıştır.
Çeşitli özelliklere sahip 31 deterjanın AD Delta Deltası'nın ham plazma membranlarından CDR1-mGHPHis'leri yatıştırma yeteneği, CDR1-mGHPHis hücreleri SDS sayfası ile test edildi. Beta ve alfa DDM Ve Fos-choline 13, CDR1-mGHPHis'i yatıştırmak için en iyi deterjanlardı. Bununla birlikte, Fos-choline 13 CDR1-mGHPHis'in kısmi hidrolizine neden olur.
%1 deterjanla çözünen ham plazma membran proteini, altı artmış 10.300 GL boyutu dışlama sütunu kullanılarak ayrıldı. Maltosides ve LMNG çıkarılan proteinlerin kromatogramları, çoğu CDR1-mGHPHis'in 15,5 milimetre CDR1-mGHPHis'te güzel şekilli bir Gauss zirvesi olarak kaçtığını gösterdi. DDM için daha yüksek tepeler, DMN G çözünür CDR1-mGHPHis'in büyük bir kısmının denatüre olabileceğini gösterdi.
Zwitterionic Fos-cholines için FSCC kromatogramlarında ve sadece Digitonin'e iki iyonik olmayan deterjan ve DDM'ye benzer bir kromatogram verdi. Fos-choline 13 simetrik keskin şekilli bir tepe verdi, ancak DDM'den önemli ölçüde daha düşük bir elution hacmi ile ima etti. Optimize edilmiş çift etiket ayrıca saflaştırma verimini artırır ve membran proteinlerinin lokalizasyonu, ticareti ve termal stabilitesinin belirlenmesine yardımcı oldu.
Heterolog ifade teknolojisi, yüksek verimli ilaç taramasında ve diğer birçok membran proteininin ayrıntılı karakterizasyonunda da kullanılabilir.
