Le protocole d’isolation de la membrane plasmique à petite échelle et la double étiquette mGFPHis fournissent une méthode économique, rapide, fiable et facile pour caractériser les protéines membranaires dans l’organisme modèle eucaryote, Saccharomyces cerevisiae. Le plus grand avantage de cette technologie est la facilité et la rapidité avec lesquelles les niveaux d’expression des protéines membranaires, les activités de l’ATP et le détergent sont les mieux adaptés à leur purification peuvent être déterminés. Cette technologie est très conviviale.
Cependant, un point important à retenir est de récolter les cellules en tant que OD 600 de 2, ce qui garantit une faible contamination mitochondriale et les activités ATPase les plus élevées possibles. Commencez par pré-cultiver une seule colonie de levure dans 10 millilitres de milieu YPD à 30 degrés Celsius pendant sept à huit heures à 200 rotations par minute. Utilisez 10 millilitres de pré-culture pour inoculer 40 millilitres de milieu YPD frais.
Ensuite, incubez les cellules à 30 degrés Celsius pendant la nuit à 200 rotations par minute jusqu’à ce que la densité cellulaire atteigne un OD 600 de un à trois. Le lendemain, récoltez 40 unités de densité optique, ou ODU, de cellules logarithmiques du visage par centrifugation à 4 200 fois G par cinq minutes à quatre degrés Celsius. Re-suspendre et laver les cellules avec 40 millilitres d’eau double distillée stérile glacée.
Répétez le lavage en utilisant un millilitre d’eau glacée avec centrifugation entre les étapes de lavage. Resséquez la pastille dans un millilitre d’eau stérile glacée et transférez la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre pré-refroidi sur glace. Récoltez des cellules à 3 300 fois G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius.
Aspirer le surnageant et re-suspendre la pastille cellulaire dans 500 microlitres de tampon homogénéisant fraîchement complété par un millimolaire de fluorure de méthylsulfate de méthyle Neal, ou PMSF. Conservez la suspension cellulaire à moins 80 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure. Décongeler les cellules sur la glace pendant environ une heure.
Ajoutez ensuite des billes de silice glacées de 0,5 millimètre de diamètre aux 500 microlitres de la suspension cellulaire pour atteindre un volume total d’un millilitre. Pour briser les cellules, vortex la suspension cellulaire à l’intensité maximale d’agitation pendant une minute, pendant six cycles, avec une période de refroidissement de trois minutes sur la glace après chaque cycle. Après le vortex, faites un trou mince au fond du tube avec une lame de scalpel chauffée et collectez l’homogénat de cellule cassé dans un autre tube de microcentrifugation glacé de 1,5 millilitre avec un spin à basse vitesse pendant 10 secondes.
Centrifuger l’homogénat cellulaire collecté à 5 156 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les débris cellulaires. Transférer 450 microlitres de surnageant dans un tube de microcentrifugation glacé de 1,5 millilitre et ajouter un millilitre de tampon d’homogénéisation glacé complété par un PMSF frais millimolaire. Pour récolter les membranes plasmiques, centrifugez la suspension cellulaire à 17 968 fois G pendant une heure à quatre degrés Celsius.
Retirez le surnageant et ajoutez 100 microlitres de tampon homogénéisant fraîchement complété par un PMSF millimolaire. Ensuite, desserrer la pastille de membrane plasmique en remuant avec l’embout de la pipette de 100 microlitres et re-suspendre la pastille en répétant le pipetage de haut en bas. Mesurez la concentration en protéines de la préparation de la membrane plasmique à l’l’éventreur à l’éventreur à l’avec un kit d’analyse des protéines compatible avec les tampons contenant l’agent réducteur et le détergent.
Conservez les membranes plasmiques à moins 80 degrés Celsius ou conservez-les sur la glace pour une utilisation immédiate. Versez quatre à cinq millilitres de gel séparateur dans l’appareil à gel assemblé jusqu’à deux centimètres du haut. Superposez soigneusement un à deux millilitres de FDS à 0,1% sur le dessus et laissez le gel de polyacrylamide se fixer pendant 60 minutes à température ambiante.
Après une heure, retirez la couche de FDS à 0,1% du gel séparateur polymérisé et rincez le gel avec de l’eau distillée double pour éliminer les traces de FDS. Versez le mélange de gel empilable sur le gel séparateur. Placez un peigne dans le gel empilable et retirez toutes les bulles d’air autour du peigne.
Laissez ensuite le gel empilable se fixer pendant 60 minutes à température ambiante. Retirez le peigne, puis rincez les fentes de gel avec de l’eau. Mettez le gel dans le réservoir de gel et remplissez le réservoir de gel jusqu’au sommet avec un tampon de fonctionnement.
Mélanger cinq à 10 microlitres d’échantillons de membrane plasmique avec des volumes égaux de deux fois le colorant à charge protéique et charger immédiatement le mélange d’échantillons dans des fentes de gel individuelles, immergées dans un tampon de fonctionnement. Chargez les marqueurs de poids moléculaire des protéines dans la gamme de 10 à 245 kilodaltons dans un emplacement séparé pour permettre l’estimation de la taille des fragments de protéines individuels. Effectuez l’électrophorèse sur gel à 200 volts jusqu’à ce que le colorant à chargement bleu atteigne le fond du gel.
Examinez le gel pour la fluorescence GFP dans le gel avec un système d’imagerie de gel. Suite à l’imagerie fluorescente fixer les protéines dans 10 à 20 millilitres de solution fixatrice de gel protéique par agitation douce du gel pendant 15 minutes à température ambiante. Rincez ensuite deux fois pendant 10 minutes avec 10 millilitres d’eau double distillée et placez le gel dans 10 millilitres de solution de coloration colloïdale de Kumasi en agitant doucement pendant une heure à température ambiante pour visualiser les bandes protéiques.
Pour une meilleure visualisation des bandes protéiques, détachant le gel une ou deux fois sur 20 millilitres d’eau distillée double pendant une heure avant d’enregistrer des images avec le système d’imagerie en gel. Une fréquence élevée de transformation de Saccharomyces cerevisiae A D Delta Delta a été obtenue avec le plasmide témoin positif PS2. Aucun transformant Eurocell Prototron n’a été obtenu pour le contrôle négatif.
Environ 50 prototrophes de cellules URA CDR1-mGFPHis transformant ont été obtenus après l’incubation de cellules AD Delta Delta transformées sur des plaques CSM moins URA pendant trois jours. Les petits transformants qui ne peuvent pas pousser sur les plaques de gélose YPG ont été éliminés. Les échantillons CDR1-mGHPHis avec des concentrations variables ont été quantifiés avec une fluorescence dans le gel.
Les intensités de fluorescence mGFP étaient linéaires sur toute la plage de concentration avec une fluorescence de fond minimale. La variation de la densité cellulaire indiquait que la rupture de 40 ODU de cellules produisait la plus haute qualité de membranes plasmiques avec l’activité LA PLUS ÉLEVÉE DE L’ATPase CDR1. Cependant, le rendement des membranes plasmiques a augmenté proportionnellement à l’augmentation des densités cellulaires.
La capacité de 31 détergents aux propriétés diverses à solubiliser les CDR1-mGHPHis à partir des membranes plasmiques brutes des cellules AD Delta Delta, CDR1-mGHPHis a été testée avec la page SDS. Beta et alpha DDM et Fos-choline 13 étaient les meilleurs détergents pour solubiliser CDR1-mGHPHis. Cependant, Fos-choline 13 provoque une hydrolyse partielle de CDR1-mGHPHis.
La protéine brute de la membrane plasmique solubilisée avec un détergent à 1 % a été séparée à l’aide d’une colonne d’exclusion de taille superos six augmentée de 10 300 GL. Les chromatogrammes des maltosides et des protéines extraites du GNLM ont montré que la plupart des CDR1-mGHPHis échappaient à un pic gaussien de forme agréable à 15,5 millimètres CDR1-mGHPHis solubilisé avec des détergents contenant du glucose, évoqué comme un pic agrégé ou agrégé large. Les pics plus élevés pour le DDM ont indiqué qu’une grande partie du CDR1-mGHPHi solubilisé DMN G peut être dénaturée.
Dans les chromatogrammes FSCC pour fos-cholines zwitterionique et deux détergents non ioniques seulement Digitonin et a donné un chromatogramme similaire à DDM. Fos-choline 13 a donné un pic symétrique de forme nette, mais il a fait allusion avec un volume d’élution significativement inférieur à celui du DDM. La double étiquette optimisée améliore également le rendement de purification et aide à déterminer la localisation, le trafic et la stabilité thermique des protéines membranaires.
La technologie d’expression hétérologue peut également être utilisée dans le dépistage de médicaments à haut débit et la caractérisation détaillée de nombreuses autres protéines membranaires.
