Протокол изоляции плазматической мембраны малого масштаба и двойная метка mGFPS обеспечивают экономичный, быстрый, надежный и простой метод характеристики мембранных белков в эукариотическом модельном организме Saccharomyces cerevisiae. Самым большим преимуществом этой технологии является легкость и скорость, с которой можно определить уровни экспрессии мембранного белка, активность АТФ и моющее средство, наиболее подходящее для их очистки. Эта технология очень удобна для пользователя.
Тем не менее, одним из важных моментов, который следует помнить, является сбор клеток в виде OD 600 из 2, что обеспечивает низкое митохондриальное загрязнение и максимально возможную активность АТФазы. Начните с предварительного культивирования одной колонии дрожжей в 10 миллилитрах среды YPD при 30 градусах Цельсия в течение семи-восьми часов при 200 оборотах в минуту. Используйте 10 миллилитров предварительной культуры для прививки 40 миллилитров свежей среды YPD.
Затем инкубируют клетки при 30 градусах Цельсия в течение ночи со скоростью 200 оборотов в минуту, пока плотность клеток не достигнет OD 600 от одного до трех. На следующий день собирают 40 единиц оптической плотности, или ODU, логарифмических лицевых клеток путем центрифугирования со скоростью 4, 200 раз G в пять минут при четырех градусах Цельсия. Повторно суспендировать и промыть клетки 40 миллилитрами ледяной холодной стерильной двойной дистиллированной воды.
Повторите промывку с использованием одного миллилитра ледяной холодной воды с центробежизацией между этапами промывки. Повторно суспендировать гранулу в одном миллилитрах ледяной холодной стерильной воды и переложить клеточную суспензию в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, предварительно охлажденный на льду. Собирайте клетки в 3 300 раз G в течение трех минут при четырех градусах Цельсия.
Аспирировать надосадочный и повторно суспендировать клеточную гранулу в 500 микролитрах гомогенизирующего буфера, только что дополненного одним миллимолярным феналом метилсульфамидного фторида Нила, или PMSF. Храните клеточную суспензию при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшего использования. Разморозить клетки на льду примерно на один час.
Затем добавьте ледяные холодные шарики кремнезема диаметром 0,5 миллиметра к 500 микролитрам клеточной суспензии, чтобы достичь общего объема в один миллилитр. Чтобы сломать клетки, вихрь клеточной суспензии с максимальной интенсивностью встряхивания в течение одной минуты, в течение шести циклов, с трехминутным периодом охлаждения на льду после каждого цикла. После вихря сделайте тонкое отверстие в нижней части трубки с нагретым лезвием скальпеля и соберите разбитую ячейку гомогената в другую ледяную холодную 1,5-миллилитровую микроцентрифугу с низкой скоростью вращения в течение 10 секунд.
Центрифугировать собранный гомогенат клеток в 5, 156 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия для удаления клеточного мусора. Переложите 450 микролитров супернатанта в ледяную холодную 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку и добавьте один миллилитр гомогенизирующего буфера ледяного холода, дополненного одним миллимолярным свежим PMSF. Для сбора плазматических мембран центрифугируют клеточную суспензию в 17,968 раз G в течение одного часа при четырех градусах Цельсия.
Удалите супернатант и добавьте 100 микролитров гомогенизирующего буфера, только что дополненного одним миллимоляром PMSF. Затем ослабьте гранулу плазматической мембраны, перемешав с помощью 100-микролитрового наконечника пипетки, и повторно приостановите гранулу путем повторного пипетирования вверх и вниз. Измерьте концентрацию белка препарата плазматической мембраны с помощью набора для анализа белка, совместимого с буферами, содержащими восстановительный агент и моющее средство.
Храните плазматические мембраны при температуре минус 80 градусов по Цельсию или храните их на льду для немедленного использования. Налейте четыре-пять миллилитров разделительного геля в собранный гель-аппарат на высоте до двух сантиметров от верха. Аккуратно наложите сверху один-два миллилитра 0,1% SDS и дайте полиакриламидного геля застыть в течение 60 минут при комнатной температуре.
Через час удалите слой 0,1% SDS из полимеризованного разделительного геля и промойте гель двойной дистиллированной водой, чтобы удалить следы SDS. Налейте смесь геля для укладки на разделительные гели. Поместите расческу в гель для укладки и удалите пузырьки воздуха вокруг гребня.
Затем дайте укладывать гель в течение 60 минут при комнатной температуре. Снимите расческу, а затем промойте гелевые пазы водой. Поместите гель в гель-резервуар и заполните гель-резервуар сверху бегущим буфером.
Смешайте от пяти до 10 микролитров образцов плазматической мембраны с равными объемами, в два раза превышающим загрузку белка красителя, и немедленно загрузите смесь образцов в отдельные гелевые щели, погруженные в работающий буфер. Загрузите маркеры молекулярной массы белка в диапазоне от 10 до 245 килодальтонов в отдельный слот, чтобы можно было оценить размер отдельных фрагментов белка. Выполняют гель-электрофорез на 200 вольт до тех пор, пока синий нагрузочный краситель не достигнет дна геля.
Изучите гель на флуоресценцию GFP с помощью гелевой системы визуализации. После флуоресцентной визуализации фиксируют белки в 10-20 миллилитрах раствора для фиксации белкового геля путем мягкого перемешивания геля в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем дважды промыть в течение 10 минут 10 миллилитрами двойной дистиллированной воды и поместить гель в 10 миллилитров коллоидного раствора для окрашивания Кумаси с нежным встряхиванием в течение одного часа при комнатной температуре для визуализации белковых полос.
Для улучшения визуализации белковых полос окрасить гель один или два раза в 20 миллилитрах двойной дистиллированной воды в течение одного часа перед записью изображений с помощью системы визуализации геля. Высокая частота трансформации Saccharomyces cerevisiae A D Delta Delta была достигнута с положительной управляют плазмидой PS2. Прототронные трансформанты Eurocell для отрицательного контроля получены не было.
Около 50 прототрофных cdR1-mGFPHis трансформантов URA клеток были получены после инкубации трансформированных клеток AD Delta Delta на пластинах CSM минус URA в течение трех дней. Миниатюрный трансформант, который не может расти на агаровых пластинах YPG, был устранен. Образцы CDR1-mGHPHis с различными концентрациями количественно оценивали с помощью флуоресценции в гегле.
Интенсивность флуоресценции mGFP была линейной во всем диапазоне концентраций с минимальной фоновой флуоресценцией. Изменение плотности клеток показало, что разрушение 40 ODU клеток дало самое высокое качество плазматических мембран с самой высокой активностью CDR1 ATPase. Однако выход плазматических мембран увеличивался пропорционально увеличению плотности клеток.
Способность 31 моющего средства с различными свойствами солюбилизировать CDR1-mGHPHis из сырых плазматических мембран клеток AD Delta Delta, CDR1-mGHPHis была проверена с помощью страницы SDS. Бета и альфа DDM и Fos-холин 13 были лучшими моющими средствами для солюбилизации CDR1-mGHPHis. Однако Фос-холин 13 вызывает частичный гидролиз CDR1-mGHPHis.
Сырой белок плазматической мембраны, солюбилизированный 1% моющим средством, отделяли с помощью суперос-шестерки увеличенной на 10 300 GL колонки исключения размера. Хроматограммы мальтозидов и LMNG-экстрагированных белков показали, что большинство CDR1-mGHPХи ускользают от пика Гаусса красивой формы при 15,5 миллиметрах CDR1-mGHPHis, солюбилизированные глюкозосодержащими моющими средствами, называемыми агрегированным или широким агрегированным пиком. Более высокие пики для DDM показали, что большая часть солюбилизированного DMN G CDR1-mGHPHis может быть денатурирована.
В FSCC хроматограммах для цвиттерионических Fos-холинов и двух неионных детергентов только Digitonin и давали аналогичную хроматограмму DDM. Фос-холин 13 давал симметричный пик острой формы, но он упоминался со значительно меньшим объемом элюдения, чем у DDM. Оптимизированная двойная метка также улучшает выход очистки и помогает определить локализацию, торговлю и термическую стабильность мембранных белков.
Технология гетерологийной экспрессии также может быть использована при высокопроизводительном скрининге лекарств и детальной характеристике многих других мембранных белков.
