Das kleine Plasmamembranisolationsprotokoll und mGFPHis Double Tag bieten eine wirtschaftliche, schnelle, zuverlässige und einfache Methode zur Charakterisierung von Membranproteinen im eukaryotischen Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae. Der größte Vorteil dieser Technologie ist die Leichtigkeit und Geschwindigkeit, mit der die Expressionsniveaus des Membranproteins, die Aktivitäten des ATP und das für ihre Reinigung am besten geeignete Reinigungsmittel bestimmt werden können. Diese Technologie ist sehr benutzerfreundlich.
Ein wichtiger Punkt, an den man sich jedoch erinnern sollte, ist die Ernte von Zellen als OD 600 von 2, was eine geringe mitochondriale Kontamination und die höchstmögliche ATPase-Aktivität gewährleistet. Beginnen Sie mit der Vorkultivierung einer einzelnen Hefekolonie in 10 Millilitern YPD-Medium bei 30 Grad Celsius für sieben bis acht Stunden bei 200 Umdrehungen pro Minute. Verwenden Sie 10 Milliliter Vorkultur, um 40 Milliliter frisches YPD-Medium zu impfen.
Dann inkubieren Sie die Zellen bei 30 Grad Celsius über Nacht mit 200 Umdrehungen pro Minute, bis die Zelldichte einen OD 600 von eins bis drei erreicht. Am nächsten Tag ernten Sie 40 optische Dichteeinheiten (ODU) logarithmischer Gesichtszellen durch Zentrifugieren bei 4.200 mal G pro fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Aufhängen und Waschen von Zellen mit 40 Millilitern eiskaltem sterilem doppelt destilliertem Wasser.
Wiederholen Sie das Waschen mit einem Milliliter eiskaltem Wasser mit Zentrifugalisierung zwischen den Waschschritten. Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter eiskaltem sterilem Wasser und geben Sie die Zellsuspension in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen, das auf Eis vorgekühlt ist. Ernten Sie Zellen bei 3.300 mal G für drei Minuten bei vier Grad Celsius.
Saugen Sie den Überstand an und suspendieren Sie das Zellpellet in 500 Mikrolitern Homogenisierungspuffer, frisch ergänzt mit einem millimolaren Fenalmethylsulfa Nealfluorid oder PMSF. Lagern Sie die Zellsuspension bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung. Tauen Sie die Zellen auf Eis für etwa eine Stunde auf.
Dann fügen Sie eiskalte Kieselsäureperlen mit einem Durchmesser von 0,5 Millimetern zu den 500 Mikrolitern der Zellsuspension hinzu, um ein Gesamtvolumen von einem Milliliter zu erreichen. Um die Zellen zu brechen, wirbeln Sie die Zellsuspension bei maximaler Schüttelintensität für eine Minute, für sechs Zyklen, mit einer dreiminütigen Abkühlperiode auf Eis nach jedem Zyklus. Nach dem Wirbeln mit einer beheizten Skalpellklinge ein dünnes Loch am Boden des Rohres machen und das gebrochene Zellhomogenat in einem anderen eiskalten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Spin mit niedriger Geschwindigkeit für 10 Sekunden sammeln.
Zentrifugieren Sie das gesammelte Zellhomogenat bei 5.156 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um Zellreste zu entfernen. 450 Mikroliter Überstand in ein eiskaltes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen geben und einen Milliliter eiskalten Homogenisierungspuffer hinzufügen, der mit einem Millimolaren frischen PMSF ergänzt wird. Um Plasmamembranen zu ernten, zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 17, 968 mal G für eine Stunde bei vier Grad Celsius.
Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 100 Mikroliter Homogenisierungspuffer hinzu, der frisch mit einem millimolaren PMSF ergänzt wird. Lösen Sie dann das Plasmamembranpellet durch Rühren mit der 100-Mikroliter-Pipettenspitze und suspendieren Sie das Pellet durch wiederholtes Pipettieren nach oben und unten. Messen Sie die Proteinkonzentration der Plasmamembranzubereitung mit einem Protein-Assay-Kit, das mit Puffern kompatibel ist, die das Reduktionsmittel und das Reinigungsmittel enthalten.
Lagern Sie die Plasmamembranen bei minus 80 Grad Celsius oder halten Sie sie zur sofortigen Verwendung auf Eis. Gießen Sie vier bis fünf Milliliter Trenngel bis zu zwei Zentimeter von oben in die zusammengesetzte Gelvorrichtung. Legen Sie vorsichtig ein bis zwei Milliliter 0,1% SDS darauf und lassen Sie das Polyacrylamidgel 60 Minuten bei Raumtemperatur einwirken.
Nach einer Stunde die 0,1% SDS-Schicht aus dem polymerisierten Trenngel entfernen und das Gel mit doppelt destilliertem Wasser abspülen, um Spuren von SDS zu entfernen. Gießen Sie die Stapelgelmischung auf das Trenngel. Legen Sie einen Kamm in das Stapelgel und entfernen Sie alle Luftblasen um den Kamm herum.
Dann lassen Sie das Stapelgel für 60 Minuten bei Raumtemperatur einwirken. Entfernen Sie den Kamm und spülen Sie dann die Gelschlitze mit Wasser ab. Legen Sie das Gel in den Geltank und füllen Sie den Geltank nach oben mit Laufpuffer.
Mischen Sie fünf bis 10 Mikroliter Plasmamembranproben mit gleichen Volumina von zweifachem Proteinbeladungsfarbstoff und laden Sie die Probenmischung sofort in einzelne Gelschlitze, die in laufbereiten Puffer getaunken sind. Laden Sie Proteinmolekulargewichtsmarker im Bereich von 10 bis 245 Kilodalton in einen separaten Slot, um die Größenschätzung einzelner Proteinfragmente zu ermöglichen. Führen Sie eine Gelelektrophorese bei 200 Volt durch, bis der blaue Ladefarbstoff den Boden des Gels erreicht.
Untersuchen Sie das Gel auf In-Gel-GFP-Fluoreszenz mit einem Gel-Bildgebungssystem. Nach der fluoreszierenden Bildgebung fixieren Proteine in 10 bis 20 Milliliter Proteingel fixierende Lösung durch sanftes Rühren des Gels für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Dann spülen Sie das Gel zweimal für 10 Minuten für 10 Minuten mit 10 Millilitern doppelt destilliertem Wasser und legen Sie das Gel in 10 Milliliter kolloidale Kumasi-Fleckenlösung mit sanftem Schütteln für eine Stunde bei Raumtemperatur, um Proteinbänder zu visualisieren.
Zur besseren Visualisierung von Proteinbändern entfärben Sie das Gel ein- bis zweimal in 20 Millilitern doppelt destilliertem Wasser für eine Stunde, bevor Sie Bilder mit dem Gel-Bildgebungssystem aufnehmen. Mit dem Positivkontrollplasmid PS2 wurde eine hohe Transformationsfrequenz von Saccharomyces cerevisiae A D Delta Delta erreicht. Für die Negativkontrolle wurden keine Eurocell Prototron-Transformanten erhalten.
Etwa 50 URA-Zell-Prototroph CDR1-mGFPHis-Transformanten wurden nach inkubation transformierter AD Delta Delta-Zellen auf CSM minus URA-Platten für drei Tage erhalten. Petite Transformant, das nicht auf YPG-Agarplatten wachsen kann, wurde eliminiert. CDR1-mGHPHis Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen wurden mit In-Gel-Fluoreszenz quantifiziert.
Die mGFP-Fluoreszenzdicken waren linear über den gesamten Konzentrationsbereich mit minimaler Hintergrundfluoreszenz. Die Variation der Zelldichte zeigte, dass das Brechen von 40 ODU von Zellen die höchste Qualität von Plasmamembranen mit der höchsten CDR1-ATPase-Aktivität ergab. Die Ausbeute der Plasmamembranen nahm jedoch proportional zur zunehmenden Zelldichte zu.
Die Fähigkeit von 31 Waschmitteln mit verschiedenen Eigenschaften, CDR1-mGHPHis aus rohen Plasmamembranen von AD Delta Delta, CDR1-mGHPHis Zellen zu solubilisieren, wurde mit SDS-Seite getestet. Beta und Alpha DDM und Fos-Cholin 13 waren die besten Reinigungsmittel, um CDR1-mGHPHis zu solubilisieren. Fos-Cholin 13 verursacht jedoch eine partielle Hydrolyse von CDR1-mGHPHis.
Rohes Plasmamembranprotein, das mit 1% Reinigungsmittel solubilisiert wurde, wurde mit einer Superos six erhöhten 10 300 GL Größenausschlusssäule getrennt. Chromatogramme von Maltosiden und LMNG-extrahierten Proteinen zeigten, dass die meisten CDR1-mGHPHis als schön geformter Gauß-Peak bei 15,5 Millimetern CDR1-mGHPHis mit glukosehaltigen Reinigungsmitteln gelöst wurden, die als aggregierter oder breiter aggregierter Peak angespielt wurden. Die höheren Peaks für DDM deuteten darauf hin, dass ein großer Teil der dmN G-gelösten CDR1-mGHPHis denaturiert sein kann.
In den FSCC-Chromatogrammen für zwitterionische Fos-Choline und zwei nichtionische Reinigungsmittel nur Digitonin und gab ein ähnliches Chromatogramm wie DDM. Fos-Cholin 13 ergab einen symmetrischen, scharf geformten Peak, spielte aber auf ein deutlich geringeres Elutionsvolumen an als das für DDM. Der optimierte Doppel-Tag verbessert auch die Reinigungsausbeute und half bei der Bestimmung der Lokalisation, des Transports und der thermischen Stabilität von Membranproteinen.
Die heterologe Expressionstechnologie kann auch im Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening und bei der detaillierten Charakterisierung vieler anderer Membranproteine eingesetzt werden.
