يصف البروتوكول كيفية إجراء الحقن الفيروسية وزرع نافذة جمجمة لتصوير خلايا الدماغ في الفئران المستيقظة والمقيدة الرأس. ميزة هذه الطريقة هي أنه يمكن تصوير بنية ونشاط الخلايا العصبية والخلايا النجمية بشكل متكرر على مدى جلسات متعددة. يمكن استخدام هذا النهج لتحديد كيفية تغيير الخلايا العصبية في نماذج من اضطرابات النمو العصبي ، أو الاضطرابات العصبية التنكسية ، أو ما إذا كانت اللدونة المعتمدة على التجربة ضعيفة.
ابدأ بتثبيت ماوس مخدر على إطار مجسمة باستخدام مشبك الخطم وقضبان الأذن. باستخدام أدوات جراحية معقمة ، قم بقص وإزالة الجلد من الغرز الأمامية الأمامية إلى البريجما إلى الخلف إلى لامدا. باستخدام شفرة جراحية معقمة بحجم 11 من الفولاذ الكربوني ، قم بكشط جميع الأنسجة الضامة بلطف من الجمجمة.
بمساعدة مثقاب الأسنان ، قم بحفر عظم الجمجمة تدريجيا على طول مخطط الفتحة في دوائر متحدة المركز لتسهيل حتى ترقق العظام. بعد كل تمريرة متحدة المركز ، أضف قطرة أو قطرتين من المياه المالحة إلى المنطقة المحفورة ، واسمح للمحلول الملحي بالجلوس لمدة 10 ثوان على الأقل قبل استئناف الحفر. ادفع بلطف على المنطقة المركزية من عظم الجمجمة باستخدام ملقط ناعم للتحقق من أن الجمجمة رقيقة بشكل كاف وتتحرك.
تأكد من أن الأوعية الدموية الأساسية التي حدث فيها الحفر سليمة ، وأن العظم غير متصدع. أدخل بعناية شفرة مدببة مصغرة بزاوية 15 درجة في العظم الرقيق وقم بقص واستخدام رغوة الجل المنقوعة في محلول ملحي لوقف أي نزيف قد يحدث. باستخدام الملقط ، ارفع العظام وأزلها بعناية ، مع الحرص على عدم إتلاف الأم الجافية.
للحقن ، املأ ماصة زجاجية مشطوفة معقمة بطرف 20 ميكرومتر بخليط الفيروس. ثم اخفض الماصة للمس سطح الدماغ ، واستمر في الانخفاض لمدة 200 إلى 300 ميكرومتر إضافي لحقن الطبقة 2/3. باستخدام نظام توزيع الحقن المجهري داخل الخلايا ، يقوم الضغط بحقن النظام من 12 إلى 15 مرة على مدار دقيقتين.
لزرع نافذة الجمجمة ، ضع زجاج الغطاء فوق الفتحة في الجمجمة. استخدم الملقط للتأكد من تدفق الزجاج فوق الفتحة. لإغلاق حواف النافذة الزجاجية على الجمجمة ، ضع هلام لاصق سيانو أكريليت حول محيط السطح الزجاجي.
فوق الجل اللاصق ، ضع طبقة من الغراء. ثم أضف طبقة من سائل أسمنت الأسنان. عندما يصلب أسمنت الأسنان ، ضع طبقة رقيقة من الغراء حول الفتحة المركزية للوحة رأس نوع المروحية ، وضع لوحة رأس من نوع المروحية بالحجم المناسب فوق زجاج الغطاء.
اترك الغراء حتى يجف. أضف مسحوق أسمنت الأسنان في أنبوب ميكروفوج سعة 1.5 ملليلتر حتى علامة 0.1 ملليلتر. امزج سبع إلى ثماني قطرات من المادة اللاصقة الفورية سريعة المعالجة في المسحوق ، واسحب الخليط الناتج في حقنة سعة ملليلتر واحد مع إبرة قياس 19 التي تم قطعها لإنشاء فتحة أكبر.
حقن خليط المسحوق من خلال الثقوب الجانبية لشريط طائرة هليكوبتر حتى يتسرب من كلا الجانبين. ضع خليط لاصق أسمنت الأسنان على بقية الجمجمة المكشوفة لربط صفيحة الرأس بالجمجمة. لف الماوس بقطعة قماش ، وقم بتثبيته عبر لوحة رأسه إلى ذراع تثبيت الرأس في القفص المنزلي المنقول جوا ، ثم اترك القفص المنزلي معرضا للضوء.
بعد وقت التعود لمدة 15 دقيقة ، قم بإزالة الماوس من القفص المنزلي. باستخدام وضع المجال الواسع للمجهر ، حدد موقعين إلى ثلاثة مواضع من الأوعية الدموية التي يمكن التعرف عليها بسهولة. احفظ صور الأوعية الدموية، وسجل إحداثيات x و y التي تظهر على وحدة التحكم في المحرك.
صورة الهياكل المشبكية للخلايا العصبية، ونشاط GCaMP6f في الخلايا النجمية. في التحليل التمثيلي ، تم تقييم جودة نافذة الجمجمة من خلال التصوير المتكرر للتشعبات والخلايا النجمية المعبرة عن GCaMP6f على مدار أيام. في نافذة جيدة ، بدت الهياكل العصبية هشة مع أشواك تغصنية مرئية بوضوح.
ظهر عمودان فقريان جديدان في اليوم الثاني من التصوير. استمر عمود فقري واحد فقط وكان مرئيا في اليوم الخامس. تمت دراسة نشاط الكالسيوم في الخلايا النجمية التي تعبر عن GCaMP6f في نقاط زمنية مختلفة.
وشهد حدث عالمي شمل الخلية بأكملها خلال نوبة حركية. الخطوتان الحاسمتان لهذا البروتوكول هما أن العظم يحتاج إلى ترقق كاف قبل إزالة العظم ، ووضع زجاج الغطاء بشكل صحيح فوق الفتحة. يمكن الجمع بين التصوير والتحليل السلوكي ، إما أثناء التصوير ، أو ما بعد السلوك ، مثل تعلم مهارة حركية جديدة ، لتحديد كيفية تعديل بنية الخلايا العصبية والخلايا النجمية ووظيفتها عن طريق التعلم.
