このプロトコルは、ウイルス注射を行い、覚醒した頭部拘束マウスの脳細胞をイメージングするための頭蓋窓を移植する方法を記述している。この方法の利点は、ニューロンおよびアストロサイトの構造および活性を複数のセッションにわたって繰り返し画像化できることである。このアプローチは、神経発達障害または神経変性障害のモデルにおいて神経細胞がどのように変化するか、または経験依存性の可塑性が損なわれているかどうかを決定するために使用することができる。
まず、鼻クランプとイヤーバーを使用して、麻酔をかけられたマウスを定位フレームに固定します。滅菌手術器具を使用して、前頭縫合糸からブレグマの前部からラムダの後部までの皮膚を切断して除去する。滅菌サイズ11炭素鋼手術用ブレードを使用して、頭蓋骨からすべての結合組織を静かにこすり取る。
歯科用ドリルの助けを借りて、頭蓋骨を同心円状に開口部の輪郭に沿って徐々にドリルして、骨の薄肉化を容易にします。同心円状のパスが終わるたびに、ドリルしたエリアに生理食塩水を1滴または2滴加え、生理食塩水を少なくとも10秒間放置してから掘削を再開します。頭蓋骨の中央部を細かい鉗子で優しく押して、頭蓋骨が十分に薄くなって動いていることを確認します。
掘削が行われた基礎となる血管系が無傷であり、骨に亀裂が入っていないことを確認してください。細くなった骨に15度の尖ったミニチュアの刃を慎重に挿入し、生理食塩水に浸したゲルフォームを切断して使用し、出血を止める。鉗子を使用して、硬膜を傷つけないように注意しながら、骨を慎重に持ち上げて取り外します。
注射のために、滅菌された面取りガラスピペットに20マイクロメートルの先端をウイルス混合物で充填する。次に、ピペットを下げて脳の表面に触れ、層2/3注射のためにさらに200〜300マイクロメートル下げ続けます。細胞内マイクロインジェクションディスペンスシステムを用いて、システムを2分間にわたって12〜15回加圧注入する。
頭蓋窓の移植のために、頭蓋骨の開口部の上にカバーガラスを置きます。鉗子を使用して、ガラスが開口部上で平らになっていることを確認します。ガラス窓の端を頭蓋骨に密封するには、ガラス表面の周囲にシアノアクリレート粘着ゲルを塗布する。
接着ゲルの上に、接着剤の層を塗布する。次に、歯科用セメント液の層を追加します。歯科用セメントが固まったら、ヘリコプター式ヘッドプレートの中央開口部に接着剤の薄い層を塗り、カバーガラスの上に適当な大きさのヘリコプター式ヘッドプレートを置きます。
接着剤を乾かします。歯科用セメント粉末を1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに0.1ミリリットルのマークまで加えます。7〜8滴の速硬化性瞬間接着剤を粉末に混合し、得られた混合物を1ミリリットルのシリンジに引き込み、19ゲージの針を切断してより大きな開口部を作ります。
混合粉末をヘリコプター バーの側面の穴から、どちらかの側から染み出すまで注入します。歯科用セメント接着剤混合物を露出した頭蓋骨の残りの部分に塗布して、ヘッドプレートを頭蓋骨に固定する。マウスを布で包み、ヘッドプレートを介して空輸されたホームケージの頭部固定アームに固定してから、ホームケージを光にさらしたままにします。
15分の慣れ時間の後、マウスをホームケージから取り出します。顕微鏡の広視野モードを用いて、容易に識別可能な血管系の2〜3つの位置を選択する。血管の画像を保存し、モーターコントローラに表示されるx座標とy座標を記録します。
ニューロンのシナプス構造、およびアストロサイトにおけるGCaMP6f活性を画像化する。代表的な解析では、頭蓋窓の質を、樹状突起およびGCaMP6f発現アストロサイトのイメージングを数日間にわたって繰り返して評価した。良い窓では、ニューロン構造ははっきりと見える樹状突起の棘で鮮明に見えました。
イメージングの2日目に2つの新しい脊椎が現れました。1つの背骨だけが持続し、5日目に見えました。カルシウム活性は、異なる時点でGCaMP6fを発現するアストロサイトにおいて研究された。
セル全体を含む世界的な出来事は、移動試合中に目撃されました。このプロトコルの2つの重要なステップは、骨を除去する前に骨を適切に薄くする必要があること、および開口部の上にカバーガラスを適切に配置する必要があることです。イメージングは、イメージング中、または新しい運動スキルの学習などの行動後の行動分析と組み合わせて、ニューロンおよびアストロサイトの構造および機能が学習によってどのように調節されるかを決定することができる。
