O protocolo descreve como realizar injeções virais e implantar uma janela craniana para imagens de células cerebrais em camundongos acordados e com a cabeça. A vantagem deste método é que a estrutura e a atividade dos neurônios e astrócitos podem ser imagens repetidamente ao longo de várias sessões. Essa abordagem pode ser usada para determinar como as células neurais são alteradas em modelos de distúrbios neurodesenvolvimentantes ou neurodegenerativos, ou se a plasticidade dependente da experiência é prejudicada.
Comece prendendo um mouse anestesiado em uma estrutura estereotaxic usando o grampo de focinho e as barras de ouvido. Utilizando ferramentas cirúrgicas estéreis, corte e remova a pele das suturas frontais anteriores à bregma posteriormente à lambda. Usando uma lâmina cirúrgica de aço carbono de tamanho 11 estéril, raspe suavemente todo o tecido conjuntivo do crânio.
Com a ajuda de uma broca dentária, perfura gradualmente o osso do crânio ao longo do contorno da abertura em círculos concêntricos para facilitar o afinamento do osso. Após cada passe concêntrico, adicione uma gota, ou duas de soro fisiológico à área perfurada, e deixe o soro fisiológico sentar-se por pelo menos 10 segundos antes de retomar a perfuração. Empurre suavemente a área central do osso do crânio com fórceps finos para verificar se o crânio está adequadamente diluído e se move.
Certifique-se de que a vasculatura subjacente onde a perfuração ocorreu está intacta, e que o osso não está rachado. Insira cuidadosamente uma lâmina pontiaguda em miniatura de 15 graus no osso fino e corte e use a espuma de gel encharcada em soro fisiológico para impedir qualquer sangramento que possa ocorrer. Usando fórceps, levante cuidadosamente e remova o osso, tomando cuidado para não danificar a dura-máter.
Para a injeção, encha uma pipeta de vidro estéril com uma ponta de 20 micrômetros com a mistura do vírus. Em seguida, baixe a pipeta para tocar a superfície do cérebro, e continue a baixar por mais 200 a 300 micrômetros para injeções de camada 2/3. Usando um sistema de dispensa de microinjeção intracelular, a pressão injeta o sistema de 12 a 15 vezes ao longo de dois minutos.
Para a implantação da janela craniana, coloque o vidro da tampa sobre a abertura no crânio. Use fórceps para garantir que o vidro esteja alinhado sobre a abertura. Para selar as bordas da janela de vidro ao crânio, aplique gel adesivo de cianoacrila ao redor do perímetro da superfície de vidro.
Sobre o gel adesivo, aplique uma camada de cola. Em seguida, adicione uma camada de líquido de cimento dental. Quando o cimento dentário endurecer, aplique uma fina camada de cola ao redor da abertura central da placa principal tipo helicóptero, e coloque a placa principal tipo helicóptero do tamanho apropriado sobre o vidro de cobertura.
Deixe a cola secar. Adicione pó de cimento dental em um tubo de microfuça de 1,5 mililitro até a marca de 0,1 mililitro. Misture sete a oito gotas de adesivo instantâneo de cura rápida no pó, e desenhe a mistura resultante em uma seringa de um mililitro com uma agulha de calibre 19 que foi cortada para criar uma abertura maior.
Injete a mistura de pó através dos orifícios laterais da barra de helicóptero até que ela escoa de ambos os lados. Aplique a mistura de adesivo de cimento dental ao resto do crânio exposto para fixar a placa da cabeça no crânio. Enrole o rato em pano e fixe-o através de sua placa da cabeça no braço de fixação da cabeça da gaiola de origem, em seguida, deixe a gaiola de casa exposta à luz.
Após um tempo de habituação de 15 minutos, remova o mouse da gaiola doméstica. Usando o modo de campo largo do microscópio, selecione duas a três posições de vasculatura facilmente identificável. Salve as imagens dos vasos sanguíneos e regissou as coordenadas x e y que aparecem no controlador do motor.
Imagem as estruturas sinápticas de neurônios, e atividade GCaMP6f em astrócitos. Na análise representativa, a qualidade da janela craniana foi avaliada com imagens repetidas de dendritos e astrócitos expressos gCaMP6f ao longo dos dias. Em uma boa janela, as estruturas neuronais pareciam nítidas com espinhas dendríticas claramente visíveis.
Duas espinhas novas apareceram no segundo dia de imagens. Apenas uma coluna persistiu e foi visível no quinto dia. A atividade de cálcio foi estudada em astrócitos expressando GCaMP6f em diferentes momentos.
Um evento global que abrange toda a célula foi testemunhado durante uma luta de locomoção. As duas etapas críticas deste protocolo são que o osso precisa ser adequadamente diluído antes da remoção do osso, e a colocação adequada do vidro de cobertura sobre a abertura. A imagem pode ser combinada com a análise comportamental, seja durante a imagem, ou pós-comportamento, como aprender uma nova habilidade motora, para determinar como a estrutura e função neuronal e astrócito é modulada pelo aprendizado.
