Bu protokol önemlidir, çünkü kullanıcıların önceki çalışmalardan toplanan ve arşivlenen donmuş dokulardan mitokondri örnekleri hazırlamalarına izin verir. Bu protokol aynı zamanda doku hasadı için canlı hayvan kullanımını da azaltır. Bu teknik, kullanıcıların yumuşak bir doku parçalama yöntemi kullanarak mitokondri zenginleştirilmiş örnekler hazırlamak için daha önce dondurulmuş arşiv dokularını kullanmalarını sağlar.
Bu hazırlık yöntemi mitokondri preparatının verimini en üst düzeye çıkarır. Protokolün okunması yoluyla, tüm bileşenlerin ve araçların, özellikle de tam yüklü öğütücü sürücüsünün kullanılabilirliğini sağlamak ve ayrıca adımlara aşina olmak için bazı istenmeyen dokularla egzersiz yapmak tavsiye edilir. Prosedürü gösteren edina Kosa, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi.
Başlangıç olarak, kalp dokusunu içeren tüpün ağırlığını kaydedin. Şimdi boş tüpü tartın ve kalp dokusunun net ağırlığını elde etmek için daha önce kaydedilmiş ağırlıktan çıkarın. Donmuş kalp dokusunu doğrudan buz gibi çözeltinin kabına koyun.
Beş dakika karıştırın. Aynı anda cımbız kullanarak dokuya mümkün olduğunca fazla kan almak için hafif bir basınç uygulayın. Dokuyu tokalarla çıkarın ve kanı çıkarmak için kalbi temiz bir filtre kağıt havlu ile sıkın.
Daha sonra dokuyu başka bir buz gibi çözelti kabına yerleştirin. Dokuyu beş dakika karıştırdıktan sonra, dokuyu bir kağıt havlu üzerinde hafifçe kurulayın ve yağ, pıhtılaşmış kan, kulak kepçesi ve fasyayı çıkarın. Ventrikül dokusunu bire birle.
Doku örneklerini parçalamak için, 50 ila 300 miligram kalp dokusunu koç tarafından doku parçalayıcı odasına yerleştirin ve koç tarafını kapatın. Daha sonra tüpün kapak tarafına yaklaşık 0,2 ila 0,8 mililitre yıkama tamponu ekleyin. Shredder odasını fazla sıkmadan shredder kapağıyla sıkıca kaplamak için tüp aracını kullanın.
Öğütücü haznesini, devreye girmek için koç tarafı aşağı olacak şekilde öğütücü tutucu ünitesine yerleştirin. Tam yüklü öğütücü sürücüsünün bitini öğütücü kapağıyla takın ve ucun yerine sıkıca kilitlenmesini sağlayın, ardından öğütücü tutucusundaki basınç göstergesi yaklaşık iki ayara ulaşana kadar öğütücü odasındaki öğütücü sürücüsüne basınç uygulayın. Tetiğe basın ve ayarı ikide tutarken öğütücü sürücüsünü yaklaşık 10 ila 12 saniye çalıştırın.
Doku kütlesinin tamamının veya çoğunun lizis diskinden üst parçalayıcı odasına parçalanıp geçirilmesini sağlamak için tüpü gözlemleyin ve gerekirse parçalamaya devam etmek için tüpü parçalayıcı tutucuya geri verin. Numuneyi parçaladıktan sonra öğütücü haznesini tutucu ünitesinden kaldırın ve diğer doku örneklerinden çapraz bulaşmayı önlemek için daha sonra sadece aynı numunede önerilen temiz bir yüzeye yerleştirmek için boru aracını kullanın. Parçalanmış kalp dokusunu bir karıştırma çubuğu ile 40 mililitre yıkama tamponu ile üçüncü kabın içine aktarın ve karıştırma plakasındayken orta hızda beş dakika boyunca dokuyu karıştırın.
Süspansiyonu önceden ıslanmış bir naylon ağ monofilamenti ile filtreleyin. Filtratı attıktan sonra, filtredeki parçalanmış dokuyu 10 mililitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Yıkanmış dokuyu, manyetik karıştırma üzerine buz banyosuna yerleştirilen 20 mililitre yıkama tamponu ile 50 mililitrelik bir kabın içine aktarın.
15 dakika boyunca sürekli karıştırırken 0,5 mililitre tripsin çözeltisi ekleyin. Karıştırmanın yaklaşık yarısında doku süspansiyonu, 15 mililitre hacim tutabilen gevşek bir şekilde monte edilmiş el camı cam üzerinde homojenizatöre aktarın. Köpüğü üretmeden süspansiyonu dört ila beş hafif vuruşla homojenize edin.
Daha sonra homojenatı 50 mililitrelik bir kabın içine yerleştirin ve karıştırma plakasına karıştırın. Daha sonra, homojenasyona tripsin inhibitörü içeren izolasyon tamponunun 10 mililitresini ekleyin ve hafifçe karıştırırken kuluçkaya yatırın. Süspansiyonu tekrar naylon filtreden geçirdikten sonra filtreyi 50 mililitrelik konik bir tüpe kaydedin ve filtrede kalan partikül fraksiyonunu cam üzerindeki homojenizatöre aktarın.
Yıkama tamponunun 15 ila 20 mililitresinde ve elle 25 ila 30 saniye boyunca hafifçe homojenize edin. Homojenatı filtratla birleştirdikten ve tüpleri denge ettikten sonra, santrifüj ve daha sonra plastik bir pipet kullandıktan sonra, kabarık peletin üstünden 0,2 mililitre bırakarak süpernatantı çıkarın. Kirlenmeyi önlemek ve bir kez daha santrifüj yapmak için naylon filtre kullanarak elde ettiği süpernatantı yeni bir konik tüpe filtreleyin.
Süpernatant attıktan sonra, peletin kırılmasını veya kirlenmesini önlemek için izolasyon tamponu tüpün yanına ekleyerek peleti iki ila üç kez yıkayın. Kabarık beyaz dış jant tabakasını her seferinde atın. Her tüpe beş mililitre izolasyon tamponu ekleyin ve bir mililitre uçlu veya yeni bir transfer pipeti içeren bir pipet kullanarak peleti parçalayın, ardından süspansiyonu 20 mililitre ek izolasyon tamponu ile seyreltin ve süspansiyonu dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 8, 500 X g'da santrifüjleyin.
Süpernatantı attıktan sonra peletı önce beş mililitreye, daha sonra 8, 500 X g'da 15 mililitrelik ek bir 15 mililitrede dört santigrat derecede 15 dakika boyunca yeniden dirildi. Şimdi süpernatantı atın ve yıkanmış bozulmamış mitokondri içeren kahverengi peleti sakla. Mitokondri zenginleştirilmiş peleti proteaz inhibitörleri de dahil olmak üzere canlandırma tamponunun 250 mikrolitresinde yeniden sunun.
Süspansiyonu 25 mikrolitre hacimde aliquot, sıvı nitrojende hızlı dondurun ve birkaç yıl boyunca 80 santigrat derece derin dondurucuda saklayın. Protokolün ardından mitokondri ile zenginleştirilmiş protein, iki grup ekmekten doğan yavruların kalbinden hazırlandı. Biri hamilelik sırasında, diğeri hareketsiz olarak egzersiz yapıldı.
ETC protein profili analizi, egzersiz yapılan ekmeklerin yavrularının bazı ETC komplekslerinde nispeten daha düşük seviyeler sunduğunu ortaya koydu. Mitokondriyal proteinler %3 ila %8 gradyan BN-PAGE'de çözümlendi ve antikor kokteylleri ile immünproblandı. Hem egzersizli hem de sedanter gruplar birden fazla süpercomplexes sergiler.
Gözlenen belirgin süperkapplex artışı, hareketsiz gruba kıyasla egzersiz grubunda dokuz ayda gerçekleşti. 48 saat üç ay, altı ay ve dokuz aylık farklı yaş gruplarından elde edilen mitokondri ile zenginleştirilmiş proteinler kinetik test kullanılarak Kompleks I-II aktivitesi için analiz edildi. Egzersiz yapılan grup, sedanter grubunkine kıyasla Karmaşık bir I-II aktivitesi gösterdi.
Donmuş doku ve hücrelerden elde edilen mitokondriler üzerinde fonksiyonel çalışmaların fizibilitesi diğer araştırmacılar tarafından gösterilmektedir. Donmuş dokudan elde edilen mitokondrilerin hazırlanması, en az hasarla çok çeşitli dokular için uygulanabilir.
