Este protocolo es significativo porque permite a los usuarios preparar muestras de mitocondrias a partir de tejidos congelados recolectados de estudios previos y archivados. Este protocolo también reduce el uso de animales vivos para la recolección de tejidos. Esta técnica permite a los usuarios utilizar tejidos de archivo previamente congelados para preparar muestras enriquecidas con mitocondrias mediante el empleo de un método suave de trituración de tejidos.
Este método de preparación maximiza el rendimiento de la preparación de mitocondrias. A través de la lectura del protocolo es recomendable garantizar la disponibilidad de todos los componentes y herramientas, especialmente la unidad de trituradora completamente cargada y también hacer ejercicio con algunos tejidos no deseados para familiarizarse con los pasos. Demostrando el procedimiento estará Edina Kosa, una investigadora asociada de mi laboratorio.
Para empezar, registre el peso del tubo que contiene el tejido cardíaco. Ahora pesa el tubo vacío y resta del peso previamente registrado para obtener un peso neto del tejido cardíaco. Coloque el tejido cardíaco congelado directamente en el vaso de precipitados de la solución helada.
Revuelva durante cinco minutos. Simultáneamente, el uso de pinzas aplica una ligera presión al tejido para extraer la mayor cantidad de sangre posible. Saque el pañuelo con fórceps y apriete el corazón con una toalla de papel de filtro limpia para eliminar la sangre.
Luego coloque el tejido en otro vaso de precipitados de solución helada. Después de remover el tejido durante cinco minutos, seque suavemente el pañuelo en una toalla de papel y retire la grasa, la sangre coagulada, las aurículas y las fascias. Agrupar el tejido ventricular.
Para triturar las muestras de tejido, coloque de 50 a 300 miligramos de tejido cardíaco en la cámara trituradora de tejido desde el lado del carnero y cierre el lado del carnero. Luego agregue aproximadamente 0.2 a 0.8 mililitros de tampón de lavado al lado de la tapa del tubo. Use la herramienta de tubo para tapar la cámara de la trituradora con la tapa de la trituradora cómodamente sin apretarla demasiado.
Coloque la cámara de la trituradora en la unidad de soporte de la trituradora con el lado del ariete hacia abajo para el ajuste comprometido. Inserte y enganche la broca del controlador de trituradora completamente cargada con la tapa de la trituradora, asegurando que la broca esté bien bloqueada en su lugar, luego aplique presión hacia abajo al conductor de la trituradora en la cámara de la trituradora hasta que el indicador de presión en el soporte de la trituradora alcance un ajuste de aproximadamente dos. Presione el gatillo y ejecute el controlador de la trituradora durante unos 10 a 12 segundos mientras mantiene la configuración en dos.
Observe el tubo para asegurar la trituración y el paso de toda o la mayor parte de la masa de tejido a través del disco de lisis a la cámara superior de la trituradora y, si es necesario, devuelva el tubo al soporte de la trituradora para continuar la trituración. Después de triturar la muestra, levante la cámara de la trituradora de la unidad de soporte y use la herramienta de tubo para quitar la tapa de la trituradora y colóquela en una superficie limpia para su uso posterior recomendado solo dentro de la misma muestra para evitar la contaminación cruzada de otras muestras de tejido. Transfiera el tejido cardíaco triturado al tercer vaso de precipitados con 40 mililitros de tampón de lavado con una barra de agitación y agite el tejido durante cinco minutos a una velocidad media mientras está en la placa de agitación.
Filtra la suspensión a través de un monofilamento de malla de nylon prehumedecido. Después de desechar el filtrado, lave el tejido triturado en el filtro tres veces con 10 mililitros de tampón de lavado. Transfiera el tejido lavado a un vaso de precipitados de 50 mililitros con 20 mililitros de tampón de lavado colocado en el baño de hielo en el agitador magnético.
Agregue 0.5 mililitros de solución de tripsina mientras remueve constantemente durante 15 minutos. Aproximadamente a la mitad de la agitación, transfiera la suspensión de tejido a un homogeneizador de vidrio sobre vidrio de mano poco ajustado que puede contener 15 mililitros de volumen. Homogeneizar la suspensión con cuatro a cinco golpes suaves sin producir espuma.
Luego, coloque el homogeneizado en un vaso de precipitados de 50 mililitros y mezcle en un plato de agitación. A continuación, agregue 10 mililitros del tampón de aislamiento que contiene el inhibidor de tripsina al homogeneizado e incube mientras se agita suavemente. Después de filtrar la suspensión nuevamente a través de un filtro de nylon, guarde el filtro en un tubo cónico de 50 mililitros y transfiera la fracción de partículas que queda en el filtro al homogeneizador de vidrio sobre vidrio.
A 15 a 20 mililitros del tampón de lavado y homogeneizar suavemente con la mano durante 25 a 30 segundos. Después de combinar el homogeneizado con el filtrado y equilibrar los tubos, centrifugar y luego usar una pipeta de plástico retirar el sobrenadante dejando 0,2 mililitros de la parte superior del pellet esponjoso. Filtre el sobrenadante resultante en un nuevo tubo cónico utilizando un filtro de nylon para evitar la contaminación y centrífuga una vez más.
Después de desechar el sobrenadante, lave el pellet dos o tres veces agregando el tampón de aislamiento al costado del tubo para evitar que se rompa o contamine el pellet. Deseche la capa de borde exterior blanco esponjoso cada vez. Agregue cinco mililitros del tampón de aislamiento a cada tubo y rompa el pellet usando una pipeta con una punta de un mililitro o una nueva pipeta de transferencia Luego diluya la suspensión con 20 mililitros de tampón de aislamiento adicional y centrifugue la suspensión a 8, 500 X g durante 15 minutos a cuatro grados Centígrados.
Después de desechar el sobrenadante, resusped el pellet primero en cinco mililitros y luego en 15 mililitros adicionales del tampón de resuspensión y la centrífuga a 8, 500 X g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Ahora deseche el sobrenadante y guarde el gránulo marrón que contiene mitocondrias intactas lavadas. Resuspend el pellet enriquecido con mitocondrias en 250 microlitros del tampón de resuspensión incluyendo inhibidores de la proteasa.
Alícuota la suspensión en 25 microlitros de volumen, congela rápidamente en nitrógeno líquido y guárdala en un congelador de 80 grados centígrados durante varios años. Siguiendo el protocolo, la proteína enriquecida con mitocondrias se preparó a partir del corazón de la descendencia nacida de dos grupos de cerdas. Uno se ejercitaba durante el embarazo y el otro era sedentario.
El análisis del perfil de proteínas de ETC reveló que la descendencia de cerdas ejercitadas presentaba niveles relativamente reducidos en algunos de los complejos de ETC. Las proteínas mitocondriales se resolvieron en un gradiente BN-PAGE de 3 a 8% y se inmunoprobieron con cócteles de anticuerpos. Tanto los grupos ejercitados como los sedentarios exhiben múltiples supercomplejos.
El aumento prominente del supercomplejo observado fue a los nueve meses en el grupo ejercitado en comparación con el grupo sedentario. Las proteínas enriquecidas con mitocondrias obtenidas de diferentes grupos de edad de 48 horas tres meses, seis meses y nueve meses fueron analizadas para la actividad del Complejo I-II utilizando un ensayo cinético. El grupo ejercitado mostró una actividad del Complejo I-II en comparación con la del grupo sedentario.
La viabilidad de los estudios funcionales sobre mitocondrias obtenidos de tejidos y células congelados es demostrada por otros investigadores. La preparación de mitocondrias obtenidas a partir de tejido congelado se puede aplicar para una amplia variedad de tejidos con un daño mínimo.
