פרוטוקול זה הוא משמעותי כי זה מאפשר למשתמשים להכין דגימות מיטוכונדריה מרקמות קפואות שנאספו ממחקרים קודמים בארכיון. פרוטוקול זה גם מפחית את השימוש בבעלי חיים לקציר רקמות. טכניקה זו מאפשרת למשתמשים להשתמש ברקמות ארכיון שהוקפאו בעבר כדי להכין דגימות מועשרות במיטוכונדריה על ידי שימוש בשיטת גריסת רקמות עדינה.
שיטה זו של הכנה ממקסמת את התשואה של הכנת המיטוכונדריה. באמצעות קריאת הפרוטוקול מומלץ להבטיח את הזמינות של כל הרכיבים והכלים במיוחד את כונן מגרסה טעון במלואו וגם לממש עם כמה רקמות לא רצויות כדי להכיר את השלבים. מדגימה את ההליך תהיה אדינה Kosa, עמית מחקר מהמעבדה שלי.
ראשית, להקליט את המשקל של הצינור המכיל את רקמת הלב. עכשיו לשקול את הצינור הריק ולהחסיר אותו מהמשקל שנרשם בעבר כדי לקבל משקל נטו של רקמת הלב. שים את רקמת הלב הקפואה ישירות לתוך של תמיסה קרה כקרח.
מערבבים אותו במשך חמש דקות. בו זמנית באמצעות פינצטה להחיל לחץ קל על הרקמה כדי לצאת דם רב ככל האפשר. מוציאים את הרקמה עם מלקחיים וסוחטים את הלב עם מגבת נייר סינון נקייה כדי להסיר דם.
ואז למקם את הרקמה לתוך אחרת של פתרון קר כקרח. לאחר ערבוב הרקמה במשך חמש דקות, לייבש בעדינות את הרקמה על מגבת נייר ולהסיר את השומן, דם קרישה, auricles ו fasciae. תאחדו את רקמת החדר.
כדי לגרוס את דגימות הרקמה, מניחים 50 עד 300 מיליגרם של רקמת לב לתוך תא מגרסת הרקמות מצד האייל וסוגרים את צד האיל. לאחר מכן להוסיף על 0.2 כדי 0.8 מיליליטר של חוצץ כביסה לצד הכובע של הצינור. השתמש בכלי הצינור כדי לכסות את תא המגרסה עם מכסה המגרסה בצורה נוחה מבלי להדק אותו יתר על המידה.
מניחים את תא המגרסה לתוך יחידת מחזיק המגרסה עם צד האיל כלפי מטה להתאמה מעורבת. הכנס ועסוק את החלק של נהג המגרסה הטעון במלואו עם מכסה המגרסה המבטיח את הסיבית נעולה בצורה נוחה למקומו ואז להפעיל לחץ כלפי מטה על נהג מגרסה בתא מגרסה עד מחוון הלחץ על מחזיק המגרסה מגיע להגדרה של כשנים בקירוב. לחץ על ההדק והפעל את מנהל ההתקן של המגרסה במשך כ-10 עד 12 שניות תוך שמירה על ההגדרה בשתיים.
שים לב לצינור כדי להבטיח גריסה והעברת כל או רוב מסת הרקמה דרך דיסק תמיסת לתוך תא המגרסה העליונה ובמידת הצורך להחזיר את הצינור למחזיק המגרסה כדי להמשיך לגרוס. לאחר גריסת הדגימה להרים את תא המגרסה מתוך יחידת המחזיק ולהשתמש בכלי הצינור כדי להסיר את מכסה המגרסה ולהניח אותו על משטח נקי לשימוש מאוחר יותר מומלץ רק בתוך אותה מדגם כדי למנוע זיהום צולב מדגימות רקמה אחרות. מעבירים את רקמת הלב הגרוסה לתוך הכיס השלישי עם 40 מיליליטר של חוצץ כביסה עם מוט ערבוב וערבבו את הרקמה במשך חמש דקות במהירות בינונית בזמן על צלחת ערבוב.
סנן את המתלים באמצעות מונפילמנט רשת ניילון רטוב מראש. לאחר השלכת הסינון לשטוף את הרקמה מגוררת על המסנן שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של חוצץ כביסה. מעבירים את הרקמה השטופה לתוך 50 מיליליטר עם 20 מיליליטר של חוצץ כביסה להציב באמבט הקרח על מערבוב מגנטי.
מוסיפים 0.5 מיליליטר של פתרון טריפסין תוך ערבוב מתמיד במשך 15 דקות. בערך באמצע ערבוב להעביר את ההשעיה רקמה לתוך homogenizer זכוכית על זכוכית מצויד באופן רופף שיכול להכיל 15 מיליליטר של נפח. הומוגניזציה ההשעיה עם ארבע עד חמש משיכות עדינות מבלי לייצר קצף.
לאחר מכן, מניחים את homogenate לתוך כף 50 מיליליטר ומערבבים על צלחת ערבוב. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של חוצץ בידוד המכיל מעכב טריפסין הומוגני ודגורה תוך ערבוב עדין. לאחר סינון המתלה שוב באמצעות מסנן ניילון לשמור את המסנן בצינור חרוטי 50 מיליליטר ולהעביר את שבר החלקיקים שנותר על המסנן הומוגניזר זכוכית על זכוכית.
ב 15 עד 20 מיליליטר של חוצץ הכביסה בעדינות הומוגני עם היד במשך 25 עד 30 שניות. לאחר שילוב הומוגנט עם סינון ואיזון הצינורות, צנטריפוגה ולאחר מכן באמצעות pipette פלסטיק להסיר את supernatant משאיר 0.2 מיליליטרים מראש הכדור רך. סנן את supernatant וכתוצאה מכך לתוך צינור חרוט חדש באמצעות מסנן ניילון כדי למנוע זיהום צנטריפוגה פעם נוספת.
לאחר השלכת supernatant לשטוף את הכדור פעמיים עד שלוש פעמים על ידי הוספת חוצץ בידוד לצד הצינור כדי למנוע שבירה או זיהום של הכדור. יש להשליך את שכבת השוליים החיצונית הלבנה הרכה בכל פעם. הוסף חמישה מיליליטר של חוצץ הבידוד לכל צינור ולשבור את הכדור באמצעות pipette עם קצה מיליליטר אחד או pipette העברה חדש ואז לדלל את המתלה עם 20 מיליליטר של חוצץ בידוד נוסף צנטריפוגה המתלה ב 8, 500 X g במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר השלכת supernatant respend הכדור הראשון בחמישה מיליליטר ולאחר מכן ב 15 מיליליטר נוסף של חוצץ resuspending וצנטריפוגה ב 8, 500 X g במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. עכשיו להשליך את supernatant ולשמור את הכדור החום המכיל מיטוכונדריה שלמה שטף. resuspend הכדור המועשר המיטוכונדריה ב 250 microliters של חוצץ resuspending כולל מעכבי פרוטאז.
Aliquot המתלים בנפח 25 מיקרוליטרים, הקפאה מהירה בחנקן נוזלי ולאחסן במקפיא עמוק 80 מעלות צלזיוס במשך כמה שנים. בעקבות הפרוטוקול החלבון המועשר במיטוכונדריה הוכן מלב הצאצאים שנולדו לשתי קבוצות של זריעה. אחד מהם אומת במהלך ההריון והשני היה בישיבה.
ניתוח פרופיל חלבון ETC גילה כי צאצאי זריעה מאומנים הציגו רמות מופחתות יחסית בחלק מתחמי ETC. חלבונים מיטוכונדריאליים נפתרו ב-BN-PAGE הדרגתי של 3 עד 8% ואימונופרו עם קוקטיילים נוגדנים. הן קבוצות פעילות גופנית והן קבוצות בישיבה מציגות מחשבי-על מרובים.
העלייה הבולטת של מחשבי העל שנצפתה הייתה בתשעה חודשים בקבוצה המתורגלת בהשוואה לקבוצה בישיבה. חלבונים מועשרים במיטוכונדריה שהתקבלו מקבוצות גיל שונות של 48 שעות שלושה חודשים, שישה חודשים ותשעה חודשים נותחו עבור פעילות I-II המורכבת באמצעות מטען קינטי. הקבוצה המתורגלת הראתה פעילות I-II מורכבת בהשוואה לפעילות של הקבוצה בישיבה.
היתכנות של מחקרים פונקציונליים על המיטוכונדריה המתקבלת מרקמות ותאים קפואים מוצגת על ידי חוקרים אחרים. הכנת המיטוכונדריה המתקבלת מרקמה קפואה עשויה להיות מיושמת על מגוון רחב של רקמות עם נזק מינימלי.
