Ce protocole est important car il permet aux utilisateurs de préparer des échantillons de mitochondries à partir de tissus congelés prélevés lors d’études antérieures et archivés. Ce protocole réduit également l’utilisation d’animaux vivants pour la récolte des tissus. Cette technique permet aux utilisateurs d’utiliser des tissus d’archives précédemment congelés pour préparer des échantillons enrichis en mitochondries en utilisant une méthode de déchiquetage des tissus en douceur.
Cette méthode de préparation maximise le rendement de la préparation des mitochondries. Grâce à la lecture du protocole, il est conseillé de s’assurer de la disponibilité de tous les composants et outils, en particulier le lecteur de broyeur entièrement chargé, et de faire de l’exercice avec certains tissus indésirables pour se familiariser avec les étapes. La démonstration de la procédure sera faite par Edina Kosa, une associée de recherche de mon laboratoire.
Pour commencer, notez le poids du tube contenant le tissu cardiaque. Maintenant, pesez le tube vide et soustrayez-le du poids précédemment enregistré pour obtenir un poids net du tissu cardiaque. Mettez le tissu cardiaque congelé directement dans le bécher de la solution glacée.
Remuez pendant cinq minutes. Simultanément, à l’aide d’une pince à épiler, appliquez une légère pression sur le tissu pour faire sortir autant de sang que possible. Retirez le mouchoir avec une pince et pressez le cœur avec une serviette en papier filtre propre pour enlever le sang.
Ensuite, placez le tissu dans un autre bécher de solution glacée. Après avoir remué le tissu pendant cinq minutes, séchez doucement le mouchoir sur une serviette en papier et retirez la graisse, le sang coagulé, les oreillettes et les fascias. Mettre en commun le tissu ventriculaire.
Pour déchiqueter les échantillons de tissus, placez 50 à 300 milligrammes de tissu cardiaque dans la chambre de broyage des tissus du côté du bélier et fermez le côté du bélier. Ajoutez ensuite environ 0,2 à 0,8 millilitre de tampon de lavage du côté du bouchon du tube. Utilisez l’outil à tube pour boucher la chambre de broyage avec le bouchon de broyeur bien serré sans trop le serrer.
Placez la chambre de broyage dans l’unité de support du broyeur avec le côté du bélier vers le bas pour un montage engagé. Insérez et engagez le mors du conducteur de broyeur complètement chargé avec le capuchon du broyeur en veillant à ce que le mors soit bien verrouillé en place, puis appliquez une pression sur le conducteur du broyeur dans la chambre de broyage jusqu’à ce que l’indicateur de pression sur le support du broyeur atteigne un réglage d’environ deux. Appuyez sur la gâchette et exécutez le pilote du broyeur pendant environ 10 à 12 secondes tout en maintenant le réglage à deux.
Observez le tube pour assurer le déchiquetage et le passage de la totalité ou de la majeure partie de la masse tissulaire à travers le disque de lyse dans la chambre supérieure de broyage et, si nécessaire, retournez le tube dans le porte-broyeur pour continuer le broyage. Après le déchiquetage de l’échantillon, soulevez la chambre de broyage hors de l’unité de support et utilisez l’outil de tube pour retirer le bouchon du broyeur et le placer sur une surface propre pour une utilisation ultérieure recommandée uniquement dans le même échantillon afin d’éviter la contamination croisée d’autres échantillons de tissus. Transférer le tissu cardiaque déchiqueté dans le troisième bécher avec 40 millilitres de tampon de lavage avec une barre d’agitation et remuer le tissu pendant cinq minutes à une vitesse moyenne sur la plaque de remuage.
Filtrer la suspension à travers un monofilament en maille de nylon pré-mouillé. Après avoir jeté le filtrat, lavez le tissu déchiqueté sur le filtre trois fois avec 10 millilitres de tampon de lavage. Transférer le tissu lavé dans un bécher de 50 millilitres avec 20 millilitres de tampon de lavage placé dans le bain de glace sur l’agitation magnétique.
Ajouter 0,5 millilitre de solution de trypsine en remuant constamment pendant 15 minutes. Environ à mi-chemin de l’agitation, transférez la suspension tissulaire dans un homogénéisateur portatif verre sur verre mal ajusté qui peut contenir 15 millilitres de volume. Homogénéiser la suspension avec quatre à cinq coups doux sans produire de mousse.
Ensuite, placez l’homogénat dans un bécher de 50 millilitres et mélangez sur une plaque à remuer. Ensuite, ajoutez 10 millilitres du tampon d’isolement contenant un inhibiteur de la trypsine à l’homogénat et incubez en remuant doucement. Après avoir filtré à nouveau la suspension à travers un filtre en nylon, enregistrez le filtre dans un tube conique de 50 millilitres et transférez la fraction particulaire laissée sur le filtre à l’homogénéisateur verre sur verre.
À 15 à 20 millilitres du tampon de lavage et homogénéiser doucement avec la main pendant 25 à 30 secondes. Après avoir combiné l’homogénat avec le filtrat et équilibré les tubes, centrifuger puis utiliser une pipette en plastique retirer le surnageant en laissant 0,2 millilitre du haut de la pastille moelleuse. Filtrer le surnageant résultant dans un nouveau tube conique à l’aide d’un filtre en nylon pour éviter la contamination et centrifuger une fois de plus.
Après avoir jeté le surnageant, lavez la pastille deux à trois fois en ajoutant le tampon d’isolation sur le côté du tube pour éviter de casser ou de contaminer la pastille. Jetez la couche de bord extérieur blanc moelleux à chaque fois. Ajouter cinq millilitres de tampon d’isolation à chaque tube et briser la pastille à l’aide d’une pipette avec une pointe d’un millilitre ou une nouvelle pipette de transfert Puis diluer la suspension avec 20 millilitres de tampon d’isolation supplémentaire et centrifuger la suspension à 8 500 X g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.
Après avoir éliminé le surnageant, remettez en suspension la pastille d’abord dans cinq millilitres, puis dans 15 millilitres supplémentaires du tampon de remise en suspension et de la centrifugeuse à 8 500 X g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Maintenant, jetez le surnageant et conservez la pastille brune contenant des mitochondries intactes lavées. Remettre en suspension la pastille enrichie en mitochondries dans 250 microlitres du tampon de remise en suspension, y compris les inhibiteurs de la protéase.
Aliquotez la suspension dans un volume de 25 microlitres, congelez rapidement dans de l’azote liquide et conservez-la dans un congélateur à 80 degrés Celsius pendant plusieurs années. En suivant le protocole, la protéine enrichie en mitochondries a été préparée à partir du cœur de la progéniture née de deux groupes de truies. L’un a été exercé pendant la grossesse et l’autre était sédentaire.
L’analyse du profil protéique ETC a révélé que la progéniture des truies exerçantes présentait des niveaux relativement réduits dans certains des complexes ETC. Les protéines mitochondriales ont été résolues dans un gradient BN-PAGE de 3 à 8% et immunoprobed avec des cocktails d’anticorps. Les groupes exercés et sédentaires présentent de multiples supercomplexes.
L’augmentation proéminente des supercomplexes observée était de neuf mois dans le groupe exercé par rapport au groupe sédentaire. Des protéines enrichies en mitochondries obtenues à partir de différents groupes d’âge de 48 heures trois mois, six mois et neuf mois ont été analysées pour l’activité du complexe I-II à l’aide d’un test cinétique. Le groupe exercé a montré une activité complexe I-II par rapport à celle du groupe sédentaire.
La faisabilité d’études fonctionnelles sur les mitochondries obtenues à partir de tissus et de cellules congelés est démontrée par d’autres chercheurs. La préparation de mitochondries obtenues à partir de tissus congelés peut être appliquée à une grande variété de tissus avec un minimum de dommages.
