このプロトコルは、ユーザーが以前の研究から収集し、アーカイブ凍結組織からミトコンドリアサンプルを調製することができるので、重要です.このプロトコルはまた、組織の収穫のための生きている動物の使用を減らす。この技術はユーザーが穏やかなティッシュの細断方法を採用することによってミトコンドリア濃縮サンプルを準備するために以前凍結されたアーカイブ組織を使用することを可能にする。
この調製方法は、ミトコンドリア製剤の収量を最大化する。プロトコルの読み取りによって、すべてのコンポーネントとツール、特に完全に充電されたシュレッダードライブの可用性を確保し、また、手順に慣れるためにいくつかの不要な組織で練習することをお勧めします。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の研究員であるEdina Kosaです。
まず、心臓組織を含む管の重量を記録する。空のチューブの重量を量り、以前に記録された重量から減算して、心臓組織の正味重量を得る。凍結した心臓組織を氷冷溶液のビーカーに直接入れます。
5分間かき混ぜます。同時にピンセットを使用すると、できるだけ多くの血液を取り出すために組織にわずかな圧力を加えます。鉗子で組織を取り出し、血液を除去するためにきれいなフィルターペーパータオルで心臓を絞ります。
その後、氷冷溶液の別のビーカーに組織を置きます。5分間組織をかき混ぜた後、ペーパータオルで組織を軽く乾かし、脂肪、凝固した血液、耳障り、筋膜を取り除きます。心室組織をプールします。
組織サンプルを細断するには、50〜300ミリグラムの心臓組織をラム側から組織シュレッダーチャンバーに入れ、ラム側を閉じる。その後、チューブのキャップ側に約0.2〜0.8ミリリットルの洗浄バッファーを加えます。チューブツールを使用して、シュレッダーキャップを締め付けることなくぴったりとシュレッダーチャンバーをキャップします。
シュレッダーチャンバーを、取り付けフィッティングのためにラム側を下にしてシュレッダーホルダーユニットに置きます。完全に充電されたシュレッダードライバーのビットをシュレッダーキャップに挿入して係合し、ビットがぴったりと所定の位置にロックされていることを確認し、シュレッダーホルダーの圧力インジケータが約2の設定に達するまでシュレッダーチャンバーのシュレッダードライバーに圧力を加えます。トリガーを押して、2で設定を維持しながら、シュレッダードライバを約10〜12秒間実行します。
チューブを観察して、ライシスディスクを通して組織質量の全部または大部分を上部シュレッダーチャンバーに通過させ、必要に応じてチューブをシュレッダーホルダーに戻して細断を続けます。サンプルを細断した後、ホルダーユニットからシュレッダーチャンバーを持ち上げ、チューブツールを使用してシュレッダーキャップを取り外し、後で同じサンプル内でのみ使用することをお勧めしてクリーンな表面に置き、他の組織サンプルからのクロス汚染を避けてください。細断された心臓組織を3番目のビーカーに3番目のビーカーに移し、40ミリリットルの洗浄バッファーを攪拌バーで回し、攪拌プレート上で中速で5分間組織をかき混ぜる。
あらかじめ濡れたナイロンメッシュモノフィラメントを通して懸濁液をフィルター処理します。濾液を廃棄した後、10ミリリットルの洗浄バッファーでフィルター上の細断された組織を3回洗浄する。洗浄した組織を50ミリリットルのビーカーに移し、20ミリリットルの洗浄バッファーを磁気攪拌機の氷浴に入れます。
常に15分間攪拌しながら、トリプシン溶液の0.5ミリリットルを追加します。攪拌の途中で、組織の懸濁液を15ミリリットルの体積を保持できる緩やかに取り付けられたハンドヘルドガラスホモジナイザーに移します。泡を生成せずに4〜5緩やかなストロークでサスペンションを均質化します。
その後、ホモジュネートを50ミリリットルのビーカーに入れ、攪拌板の上で混ぜます。次に、トリプシン阻害剤を含む分離バッファーを10ミリリットルをホモジネートに加え、穏やかに攪拌しながらインキュベートする。ナイロンフィルターを通して再び懸濁液を濾過した後、50ミリリットルの円錐管にフィルターを保存し、ガラスオンガラスホモジナイザーにフィルタに残された微粒子分を転送します。
15~20ミリリットルの洗浄バッファーで、手で25~30秒間穏やかに均質化します。ホモジュネートと濾液を組み合わせてチューブのバランスを取った後、遠心分離機を使用し、プラスチックピペットを使用して、ふわふわペレットの上部から0.2ミリリットルの上清を除去します。ナイロンフィルターを使用して、新しい円錐形チューブに得られた上澄み物をフィルター処理し、汚染と遠心分離をもう一度避けます。
上清を捨て、ペレットを破ったり汚染するのを防ぐために、チューブの側面に分離バッファーを加えてペレットを2〜3回洗浄します。ふわふわした白い外縁層を毎回捨てます。各チューブに5ミリリットルの分離バッファーを加え、1ミリリットルのチップまたは新しいトランスファーピペットを使用してペレットを分割し、20ミリリットルの追加分離バッファーで懸濁液を希釈し、懸濁液を摂氏4度で15分間15分間遠心分離します。
上清を廃棄した後、ペレットを最初に5ミリリットルで再懸濁し、次に再懸濁バッファーと遠心分離機の15ミリリットルを8、500 X gで摂氏4度で15分間再懸濁させた。上清を捨てて、洗ったミトコンドリアを含む茶色のペレットを保存します。ミトコンドリア濃縮ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含む再懸濁バッファーの250マイクロリットルで再懸濁する。
アリコート25マイクロリットルの容量の懸濁液、液体窒素での迅速な凍結および数年間の摂氏80度の深い冷凍庫に貯蔵する。プロトコルに従ってミトコンドリア濃縮タンパク質は、雌豚の2つのグループに生まれた子孫の心臓部から調製された。一人は妊娠中に運動され、もう一人は座っていた。
ETCタンパク質プロファイル分析は、運動雌豚の子孫がいくつかのETC複合体で比較的減少したレベルを提示することを明らかにした。ミトコンドリアタンパク質を3~8%のグラジェントBN-PAGEで分解し、抗体カクテルで免疫プローブした。運動グループと座りっぱなし群の両方が複数の超複合体を示す。
観察された顕著な超複合体の増加は、座りっぱなし群と比較して、運動群で9ヶ月であった。キネティックアッセイを用いて、48時間3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月の異なる年齢層から得られたミトコンドリア濃縮タンパク質を、複雑なI-II活性について分析した。運動したグループは、座りっぱなし群と比較して複雑なI-II活性を示した。
凍結組織および細胞から得られたミトコンドリアに関する機能研究の実現可能性は、他の研究者によって示されている。凍結組織から得られたミトコンドリアの調製は、損傷を最小限に抑えて多種多様な組織に適用され得る。
