שיטות אלה מאפשרות הערכה מהירה האם מניפולציה ניסיונית, חלבון סיבתי למחלה או RNA יכולים להשפיע על תהליכים סינפטיים, והאם תרכובות טיפוליות יכולות לשחזר את התפקוד. טכניקות אלה מספקות קריאה אמינה של תפקוד סינפטי מקבוצת נוירונים בפרק זמן קצר יחסית בהשוואה לאלקטרופיזיולוגיה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל מחלה של התפתחות עצבית או ניוון.
זה עובד היטב עבור תרבויות עצביות מכרסמים ראשוניים, עבור נוירונים נגזר תאי גזע pluripotent המושרה. כדי להתחיל, מטב את הגדרות רכישת התמונה באמצעות תוכנת רכישת הדמיה קונפוקלית. שמור על זמן חשיפה לכוח עירור, רווח גלאי וקצב פריימים קבוע בכל הדגימות.
להדמיית זמן לשגות, בחר יחס גובה-רוחב של 512 על 512 וקצב פריימים של שתי תמונות לשניה כדי למזער את הלבנת הצבע. לאחר מכן בחרו את שילובי עירור הפלואורסצנטיות, הדיכרויים ומסנני הפליטה עבור GCaMP שישה M/GCaMP 3 עם צבע פיצי וסטרוויל עם Trixi. כדי למנוע נדידת Z במהלך הדמיית זמן לשגות זמן, השתמש בתכונת המיקוד המושלמת של תוכנת רכישת הדמיה קונפוקלית.
לאחר מכן, בחרו בכרטיסיית הזמן בחלונית רכישת התמונות. עבור השלב הראשון, הגדר מרווח זמן של 500 אלפיות השנייה ומשך שלוש עד חמש דקות. ולשלב השני, קבע מרווח זמן של 500 אלפיות השנייה ומשך הזמן, חמש דקות.
לאחר מכן כדי להרכיב את מנגנון זלוף הכבידה עבור נוזל שדרתי מלאכותי או ACSF, לטעון את מאגר ACSF אשלגן כלוריד גבוה לתוך מזרק 50 מיליליטר בחלק העליון של המנגנון ולהגדיר את קצב הזרימה למיליליטר אחד לדקה. לאחר מכן, לטעון צלחת זכוכית 35 מיליליטר המכיל נוירונים על שלב הדמיה confocal עם סוף צינורות זלוף להציב בקצה המנה ולבחור את השדה להדמיה. 48 שעות לאחר ההעברה, דגירה הנוירונים קליפת המוח או המוטורי העיקריים במאגר ACSF אשלגן כלורי נמוך במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן להסיר את החיץ על ידי שאיפה באמצעות פיפטה, לטעון את הנוירונים בחושך על צלחת פטרי התחתון זכוכית מלא ACSF המכיל 50 מילימטר אשלגן כלורי ו 10 מיקרו טוחן צבע סטיירל. לאחר חמש דקות, להסיר את פתרון הטעינה לרחוץ את הנוירונים במאגר ACSF אשלגן כלורי נמוך ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי לחסל את טעינת צבע לא ספציפי. לאחר מכן הניחו את המנה על שלב ההדמיה של המיקרוסקופ הקונפוקלי ההפוך והתבוננו בתאים תחת יעד אוויר של פי 20 או 40 פעמים מטרת טבילה בשמן.
לרגש את צבע הפלדה באמצעות לייזר 546 ננומטר ולאסוף פליטה באמצעות מסנן פס 570 עד 620 ננומטר. לאחר בחירת שדה ההדמיה ומיקוד מושלם, צלמו תמונת סטילס אחת עם שדות בהירים, ערוצי טריקסי וסמן פלואורסצנטיות כדי לסמן גבולות עצביים. לאחר מכן הפעל את Run Now בתוכנת הרכישה ובצע את ההקלטה הבסיסית במשך שלוש עד חמש דקות כדי לא לכלול וריאציות בעוצמת הצבע.
ממש במעבר לשלב השני, הפעל את כפתור ההפעלה של מערכת הזלוף וכל הזמן perfuse 50 מילימולר אשלגן כלורי לנוירונים כדי להקל על פריקת צבע. בצע את ההקלטות במשך חמש דקות ולאחר מכן הפעל את מתג הכיבוי עבור מערכת הזלוף. שמור את הניסוי לניתוח נתונים מאוחר יותר באמצעות תוכנת הקונפוקל.
48 שעות לאחר טרנספקטה עם GCaMP שש M, לדגור נוירונים קליפת המוח מכרסם העיקרי עם אשלגן נמוך כלוריד ACSF במשך 15 דקות. לאחר מכן הר את המנה על פלטפורמת ההדמיה ודמיין את הפלואורסצנטיות GCaMP six M באמצעות מסנן Fitzy ואובייקטה של פי 20 או 40. לאחר בחירת שדה ההדמיה ומיקוד מושלם, צלמו תמונת סטילס אחת עם ערוצי סמן ברייטפילד, פיצי ופלואורסצנטיות כדי לסמן גבולות עצביים.
לאחר מכן, ליזום Run Now בתוכנת הרכישה ולבצע את ההקלטה הבסיסית במשך שלוש עד חמש דקות. לאחר מכן perfuse ACSF המכיל 50 מילימולר אשלגן כלורי לנוירונים כפי שהוכח בעבר ולהקליט במשך חמש דקות. כאשר רכישת התמונה נעצרת, שמור את הניסוי והמשיך לניתוח נתונים באמצעות תוכנת הקונפוקל.
לניתוח תמונה, פתחו את תמונות הזמן בתוכנת הקונפוקל ויישרו את התמונות על-ידי לחיצה על תמונה, ואחריה עיבוד ולאחר מכן יישרו את המסמך הנוכחי, ולאחר מכן בחרו 'ישר למסגרת הראשונה'. בחר אזורים מעניינים לאורך הנוירוריטים באמצעות הכלי בחירת ROI וגם סמן החזר השקעה המייצג את עוצמת הפלואורסצנטיות ברקע. לאחר מכן, הפעל את פונקציית המידה מלוח מדידת הזמן כדי למדוד פלואורסצנטיות גולמית לאורך זמן עבור החזרי ההשקעה שנבחרו.
לאחר המדידה יצא את עוצמות הפלואורסצנטיות הגולמיות לתוכנת הגיליון האלקטרוני. נוירונים קליפת המוח העיקריים חולדה מתורבתת עמוסים בצבע סטיל מוצגים כאן. הספציפיות של טעינת צבע נקבעה על ידי תיוג משותף עם סמן שלפוחית סינפטית סינפטופיזין ורוב puncta חיובי צבע סטרילי הם חיוביים שיתוף עבור סמן זה.
הניתוח של ערכי העוצמה הגולמית לאורך כל תקופת ההדמיה מגלה כי סינפטופיזין ועוצמה נשאר קבוע בעוד עוצמת צבע styryl פוחתת בעקבות גירוי. עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק עבר נוירונים שליטה, שחרור שלפוחית סינפטי מוצלח הביא לאובדן מרשים של פלואורסצנטי צבע על דלפולריזציה גבוהה אשלגן כלורי. סרטון מייצג זה מציג נוירון פורק באופן סלקטיבי צבע סטיל באזור ימין חדש בעקבות גירוי.
לעומת זאת, בתאי עצב שעברו עם C9 ORF 72 המקושר למבנה חוזר של פפטיד צבע ל- GA 50, שידור סינפטי לקוי מיוצג על ידי פלואורסצנטיות צבע שמורה גם לאחר דה-פולאריזציה גבוהה של אשלגן כלורי. תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של נוירונים קליפת המוח transfected עם GCaMP שישה M לפני ואחרי אשלגן כלורי depolarization מוצגים כאן. ערכי פלואורסצנטיות מוגברים ונוירונים בקליפת המוח שעברו עם GCaMP six M מצביעים על כניסת סידן לנוריטים בעקבות דה-פולאריזציה של אשלגן כלורי.
בסוף תקופת ההקלטה הבסיסית, הנוירונים הביעו GCaMP שישה M עם פלואורסצנטיות נמוכה. עלייה דרמטית פלואורסצנטית נצפתה לאחר מכן בתחילת הגירוי. ודא שההקלטות הבסיסיות של פלואורסצנטיות עבור צבע סטייריל ו- GCaMP יציבות.
השתמש תמיד במיקוד מושלם כדי למנוע סחיפה של תמונה, מה שיהפוך את עיבוד נתוני הפוסט למאתגר. פולחן נוסף של נוירונים אינו מומלץ, כמו מנות חשופות לאוויר במהלך שפע. עם זאת, כתמי אימונו או מיצוי של חלבון או RNA יכול להעריך את הגורמים הפוטנציאליים לשינויים סינפטיים.
