이러한 방법은 실험적 조작, 질병 원인 단백질 또는 RNA가 시냅스 과정에 영향을 줄 수 있는지, 치료 화합물이 기능을 회복 할 수 있는지 여부에 대한 신속한 평가를 가능하게합니다. 이러한 기술은 전기 생리학에 비해 비교적 짧은 시간 내에 뉴런 그룹으로부터 시냅스 기능의 신뢰할 수있는 판독을 제공합니다. 이 프로토콜은 뉴런 발달 또는 퇴행의 임의의 질환에 적용될 수 있다.
이것은 일차 설치류 뉴런 배양 및 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 뉴런에 잘 작동합니다. 시작하려면 공초점 이미징 수집 소프트웨어를 사용하여 이미지 수집 설정을 최적화하십시오. 여기 전력 노출 시간, 검출기 게인 및 프레임 속도를 모든 샘플에서 일정하게 유지하십시오.
시간 경과 이미징의 경우 512 x 512의 종횡비와 초당 두 이미지의 프레임 속도를 선택하여 염료 표백을 최소화하십시오. 그런 다음 Fitzy 및 Trixi가있는 stearoyl 염료가있는 GCaMP six M / GCaMP 세 가지에 대한 형광 여기, 이색성 및 방출 필터 조합을 선택하십시오. 타임랩스 이미징 중에 Z 드리프트를 방지하려면 공초점 이미징 수집 소프트웨어의 완벽한 초점 기능을 사용하십시오.
그런 다음 이미지 수집 패널에서 시간 탭을 선택하십시오. 단계 1의 경우 간격을 500밀리초로 설정하고 지속 시간을 3~5분으로 설정합니다. 그리고 두 번째 단계의 경우 간격을 500 밀리 초로 설정하고 지속 시간, 5 분을 설정하십시오.
그런 다음 인공 뇌척수액 또는 ACSF용 중력 관류 장치를 조립하기 위해 고 염화칼륨 ACSF 버퍼를 장치 상단의 50 밀리리터 주사기에 넣고 유량을 분당 한 밀리리터로 설정합니다. 그런 다음 뉴런이 들어있는 35 밀리리터 유리 접시를 공초점 이미징 단계에 넣고 접시 가장자리에 놓인 관류 튜브의 끝과 이미징 필드를 선택하십시오. 형질감염 후 48시간에, 섭씨 37도에서 10분 동안 저염화칼륨 ACSF 완충액에서 일차 피질 또는 운동 뉴런을 인큐베이션한다.
그런 다음 흡인에 의해 버퍼를 제거하고 피펫을 사용하여 어둠 속에서 뉴런을 50 밀리몰 염화칼륨 및 10 마이크로 몰 스티릴 염료를 함유하는 ACSF로 채워진 유리 바닥 페트리 접시에 로딩한다. 5분 후, 로딩 용액을 제거하고 뉴런을 섭씨 37도에서 저염화칼륨 ACSF 버퍼에서 10분 동안 목욕시켜 비특이적 염료 로딩을 제거하였다. 그런 다음 접시를 거꾸로 된 공초점 현미경의 이미징 단계 위에 놓고 20 배 공기 목표 또는 40 배 오일 침지 목표 하에서 세포를 관찰하십시오.
546 나노미터 레이저를 사용하여 강철 염료를 여기시키고 570 내지 620 나노미터 대역통과 필터를 사용하여 방출을 수집한다. 이미징 필드를 선택하고 완벽한 초점을 맞춘 후 밝은 필드, Trixi 및 형광 마커 채널로 단일 스틸 이미지를 촬영하여 신경 경계를 표시하십시오. 그런 다음 획득 소프트웨어에서 Run Now를 시작하고 염료 강도의 변화를 배제하기 위해 삼 ~ 다섯 분 동안 기본 녹음을 수행하십시오.
두 번째 단계로 전환하는 바로 단계에서 관류 시스템의 온 버튼을 트리거하고 50 밀리몰 염화칼륨을 뉴런에 지속적으로 관류하여 염료 언로드를 용이하게합니다. 다섯 분 동안 녹음을 수행 한 다음 관류 시스템의 꺼짐 스위치를 트리거하십시오. 나중에 공초점 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 위해 실험을 저장합니다.
GCaMP six M으로 형질감염 후 48시간, 15분 동안 저염화칼륨 ACSF로 일차 설치류 피질 뉴런을 인큐베이션한다. 그런 다음 접시를 이미징 플랫폼에 장착하고 Fitzy 필터와 20 배 또는 40 배 목표를 사용하여 GCaMP 여섯 M 형광을 시각화했습니다. 이미징 필드를 선택하고 완벽한 초점을 맞춘 후 밝은 필드, Fitzy 및 형광 마커 채널로 단일 스틸 이미지를 촬영하여 신경 경계를 표시하십시오.
그런 다음 획득 소프트웨어에서 Run Now를 시작하고 삼 ~ 다섯 분 동안 기본 녹음을 수행하십시오. 그런 다음 이전에 입증 된 바와 같이 50 밀리몰 염화칼륨을 함유 한 ACSF를 뉴런에 관류하고 5 분 동안 기록하십시오. 이미지 수집이 중지되면 실험을 저장하고 공초점 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 진행하십시오.
이미지 분석을 위해 공초점 소프트웨어에서 타임랩스 이미지를 열고 이미지를 클릭하여 이미지를 정렬한 다음 처리한 다음 현재 문서를 정렬한 다음 첫 번째 프레임에 정렬을 선택합니다. ROI 선택 도구를 사용하여 신경돌기를 따라 관심 영역을 선택하고 배경 형광 강도를 나타내는 ROI를 표시합니다. 다음으로, 시간 측정 패널에서 측정 기능을 시작하여 선택한 ROI에 대한 시간에 따른 원시 형광을 측정합니다.
측정 후 원시 형광 강도를 스프레드 시트 소프트웨어로 내보냅니다. 배양된 래트 일차 피질 뉴런에 스티릴 염료가 로딩되어 여기에 도시되어 있다. 염료 로딩의 특이성은 시냅스 베시클 마커 시냅토피신과의 공동 표지에 의해 결정되었고, 대부분의 멸균 염료 양성 펑타는이 마커에 대해 공동 양성이다.
전체 이미징 기간 동안 원시 강도 값을 분석한 결과, 시냅토피신과 강도는 일정하게 유지되는 반면 스티릴 염료 강도는 자극 후 감소한다는 것을 알 수 있습니다. 녹색 형광 단백질 형질감염된 대조군 뉴런의 경우, 성공적인 시냅스 소포 방출은 높은 염화칼륨 탈분극시 염료 형광의 현저한 손실을 초래했다. 이 대표적인 비디오는 자극 후 새로운 오른쪽 영역에서 스티릴 염료를 선택적으로 언로딩하는 뉴런을 보여준다.
대조적으로, GA 50에 염료 펩티드 반복 작제물에 연결된 C9 ORF 72로 형질감염된 뉴런에서, 손상된 시냅스 투과는 높은 염화칼륨 탈분극 후에도 보유된 염료 형광으로 나타난다. GCaMP 식스 M 염화칼륨 탈분극 전후의 피질 뉴런의 대표적인 형광 이미지가 여기에 제시되어 있다. 증가된 형광 값 및 GCaMP six M으로 형질감염된 피질 뉴런은 염화칼륨 유도 탈분극 후 신경돌기로의 칼슘 진입을 나타낸다.
기준선 기록 기간의 끝에서, 뉴런은 낮은 형광을 갖는 GCaMP 식스 M을 발현하였다. 극적인 형광 증가는 자극의 시작에서 관찰된다. 스티릴 염료 및 GCaMP에 대한 형광 기준선 기록이 안정적인지 확인하십시오.
이미지 드리프트를 피하기 위해 항상 완벽한 초점을 사용하므로 포스트 이미지 데이터 처리가 어려워집니다. 뉴런의 추가 배양은 요리가 번식하는 동안 공기에 노출되기 때문에 권장되지 않습니다. 그러나, 단백질 또는 RNA의 면역 염색 또는 추출은 시냅스 변화의 잠재적 원인을 평가할 수 있다.
