هذه التقنية مهمة لأنها يمكن أن تقيس امتصاص الجلوكوز في خلايا محددة في أنسجة دروسوفيلا الحية. يوفر المستشعر القائم على FRET مقياسا مباشرا للتغيرات في مستويات الجلوكوز داخل الخلايا. تسمح هذه التقنية للباحثين بتقييم التغيرات في مستويات الجلوكوز في الوقت الحقيقي، داخل الخلايا العصبية الحركية الحية من نماذج ALS مقابل عناصر التحكم.
جانب التحدي هو تصوير نفس المجموعة من الخلايا العصبية بعد تغيير المخزن المؤقت. ترك العينة على المجهر يساعد على ضمان أن VMC يتحرك أقل قدر ممكن. قبل البدء في تشريح بدوره على المجهر التصوير وأشعة الليزر.
ثم جمع تجول اليرقة نجمة الثالثة، شطفه بالماء المقطر مزدوجة ووضعها في قطرة من العازلة HL3 على طبق اصطف الاستومر المعدة سابقا. بعد ذلك تحت مجهر تشريح ، استخدم زوجا من ملقط لتثبيت النهايات الأمامية والخلفية لليرقة ، الجانب الظهري لأعلى ، عن طريق تمديد طول اليرقة بعناية مع دبابيس الحشرات. باستخدام زوج من مقص إيريس الزاوية، وجعل شق فقط فوق دبوس الخلفي.
ثم جعل قطع عمودي من شق نحو الطرف الأمامي من اليرقة. بعد إضافة بضع قطرات من العازلة HL3 إذا لزم الأمر، وإزالة القصبة الهوائية وبقية الأعضاء العائمة دون إزعاج الجهاز العصبي المركزي. ثم دبوس اللوحات، وتمتد جدار الجسم لفضح الجهاز العصبي المركزي مع الحفاظ على الجهاز العصبي العضلي سليمة.
للحصول على الصورة، استخدم المجهر البؤري المستقيم مع عدسة غمر الماء 40 مرة. ثم حدد ليزر نانومتر 405 لإثارة CFP. بعد ذلك، قم بتحسين معلمات الامتلاك مثل سرعة المسح الضوئي، والمتوسط، والهدف، وحجم الثقب التكبير، والدقة المكانية.
ضبط كسب بحيث تكون الإشارة في النطاق الديناميكي الأمثل واستخدام نفس المعلمات لجميع الأنماط الجينية. لتصوير الخلايا العصبية الحركية داخل سلك العصب البطني، ضع طبق السيليكون مع العينة المتشرحية تحت العدسة وخفض العدسة بحيث يأتي في اتصال مع العازلة HL3 السكروز trehalose. تأكد من أن العدسة مغمورة بالكامل في المخزن المؤقت وإضافة المزيد من المخزن المؤقت إذا لزم الأمر. مقبل.
باستخدام قنوات CFP و FRET ، حدد يدويا اختيارا بصريا يتكون من ست خلايا عصبية محركية على الأقل في التركيز تقع على طول خط منتصف سلك العصب البطني. ثم الحصول على الصور كل 10 ثانية لمدة 10 دقائق. تمثل هذه الصور خط الأساس.
لتحفيز الجلوكوز، قم بإزالة السكروز تريهالوز التي تحتوي على العازلة HL3 باستخدام ماصة باستور وإضافة خمسة جلوكوز ملليمولار تكمل HL3 العازلة دون تحريك الحبل العصبي البطني. ثم الحصول على الصور كل 10 ثوان لمدة 10 دقائق أخرى. تمثل هذه الصور مرحلة التحفيز.
حفظ الصور كملفات CZI أو أي نوع ملف مدعوم من قبل برنامج التصوير مع اسم ملف بما في ذلك التاريخ والخلفية الوراثية والحالة التجريبية والقنوات المستخدمة. إعادة استخدام المعلمات لتصوير كافة الأنماط الجينية. لمعالجة الصور فتح برنامج التصوير فيجي-ImageJ، ثم فتح الملفات CZI، واختيار عرض المكدس مع كومة فرط ووضع اللون لتعيين مقياس رمادي وحدد تقسيم القنوات إلى نوافذ منفصلة. مقبل.
معالجة الصور باستخدام الانجراف تصحيح المكونات الإضافية، توربو ريج وريج المكدس. يتم تصحيح كل قناة بشكل منفصل عن طريق تحديد رص الرص تحت المكونات الإضافية ثم اختيار التحويل إلى الترجمة. اختر يدويا المناطق ذات الاهتمام أو ROIs عن طريق تتبع جميع الخلايا العصبية الحركية التي لا تزال في التركيز على مدى سلسلة زمنية كاملة.
ثم استخدم مدير عائد الاستثمار لحفظ كل مخطط الخلايا العصبية الحركية. استخدم دالة القياس المتعدد لقياس متوسط القيمة الرمادية في كل عائد استثمار في كل نقطة زمنية. ثم نسخ ROIs تتبع من القناة الأولى إلى القناة الثانية لصورة التحفيز المسبق.
لتحليل البيانات، حساب FRET بواسطة CFP نسبة باستخدام القيم الرمادية المتوسطة لقنوات FRET وCFP. تعكس التغيرات في نسب FRET بواسطة CFP التعديلات في تركيز الجلوكوز داخل الخلايا. ثم رسم FRET بنسب CFP لكل عائد الاستثمار ونقطة زمنية مقابل الوقت.
تم استخدام مستشعر الجلوكوز المشفر وراثيا FRET لقياس امتصاص الجلوكوز في الخلايا العصبية الحركية. عندما الجلوكوز غير ملزمة للاستشعار، يسبب الإثارة CFP انبعاثات CFP فقط. وعندما يرتبط الجلوكوز، يمكن الكشف عن إشارة YFP بسبب FRET التي تحدث بين CFP و YFP.
تظهر هنا صور إشارات FRET و CFP في عناصر التحكم في مستشعر الجلوكوز في الخلايا العصبية المتحولة TDP-43 في ظل ظروف خط الأساس والتحفيز. ويرد بيان الخلايا العصبية الحركية ممثل في كل صورة كمثال على العائد على الاستثمار. عند تحفيز الجلوكوز، والسيطرة على الخلايا العصبية الحركية التعبير عن أجهزة استشعار الجلوكوز، وتظهر زيادة طفيفة في امتصاص الجلوكوز في حين أظهرت الخلايا العصبية التي تعبر عن TDP-43 امتصاص الجلوكوز أعلى بكثير.
تم تطبيع مزيد من FRET من نسب CFP من الخلايا العصبية الحركية المتحولة TDP-43 إلى ضوابط استشعار الجلوكوز في كل نقطة زمنية. وفي ظل ظروف خط الأساس، لم يكن هناك فرق بين الأنماط الجينية. ومع ذلك ، عند تحفيز الجلوكوز ، لوحظت زيادة سريعة وكبيرة في امتصاص الجلوكوز في المسوخ TDP-43 مقارنة بالتحكم.
في تمثيل الرسم البياني الشريطي ، أظهر تحفيز الجلوكوز في الخلايا العصبية التي تعبر عن مستشعر الجلوكوز زيادة صغيرة ولكنها كبيرة في FRET بنسبة CFP مقارنة بخط الأساس. في المقابل أظهرت الخلايا العصبية التي تعبر عن TDP-43 زيادة كبيرة في النسبة عند التحفيز مقارنة بخط الأساس. الفرق الصافي في FRET بنسب CFP بين الخلايا العصبية الحركية التي تعبر عن TDP-43 ومستشعر الجلوكوز حوالي 10.9٪ إدارة الوقت أمر بالغ الأهمية لهذا الإجراء بحيث لا تموت الخلايا العصبية على مدار التصوير.
من المهم تصوير التشريح مباشرة لتجنب ذلك. سلطت هذه التقنية الضوء على أهمية استقلاب الجلوكوز في الخلايا العصبية وقادت مجموعتنا إلى مزيد من التحقيق في دور انحلال الجليكوليسيس في تجديد الخلايا العصبية الحركية.
