Эти методы позволяют быстро оценить, может ли экспериментальная манипуляция, болезнетворный белок или РНК влиять на синаптические процессы и могут ли терапевтические соединения восстанавливать функцию. Эти методы обеспечивают надежное считывание синаптической функции из группы нейронов за относительно короткий период времени по сравнению с электрофизиологией. Этот протокол может быть применен к любому заболеванию развития нейронов или дегенерации.
Это хорошо работает для первичных нейронных культур грызунов и для нейронов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Для начала оптимизируйте параметры получения изображений с помощью программного обеспечения для сбора конфокальных изображений. Держите время экспозиции мощности возбуждения, коэффициент усиления детектора и частоту кадров постоянными во всех образцах.
Для покадровой съемки выберите соотношение сторон 512 на 512 и частоту кадров два изображения в секунду, чтобы свести к минимуму отбеливание красителя. Затем выберите комбинации флуоресцентного возбуждения, дихроинового и эмиссионного фильтров для GCaMP шести M/GCaMP три с Fitzy и стеароиловый краситель с Trixi. Чтобы избежать дрейфа Z во время покадровой съемки, используйте идеальную функцию фокусировки программного обеспечения для сбора конфокальных изображений.
Затем выберите вкладку времени на панели получения изображения. Для первой фазы установите интервал 500 миллисекунд и продолжительность от трех до пяти минут. А для второй фазы установите интервал 500 миллисекунд и продолжительность пять минут.
Затем, чтобы собрать гравитационный перфузионный аппарат для искусственной спинномозговой жидкости или ACSF, загрузите буфер с высоким содержанием хлорида калия ACSF в шприц на 50 миллилитров в верхней части аппарата и установите скорость потока на один миллилитр в минуту. Затем загрузите стеклянную тарелку объемом 35 миллилитров, содержащую нейроны, на конфокальную стадию визуализации с концом перфузионной трубки, помещенной на край чашки, и выберите поле для визуализации. Через 48 часов после трансфекции инкубируют первичные корковые или моторные нейроны в буфере ACSF с низким содержанием хлорида калия в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия.
Затем снимите буфер путем аспирации и с помощью пипетки загрузите нейроны в темноте на стеклянную нижнюю чашку Петри, заполненную ACSF, содержащую 50 миллимоляров хлорида калия и 10 микромолярного стирилового красителя. Через пять минут удалите нагрузочный раствор и вбавьте нейроны в буфер ACSF с низким содержанием хлорида калия при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут, чтобы устранить неспецифическую нагрузку красителя. Затем поместите чашку на стадию визуализации перевернутого конфокального микроскопа и наблюдайте за клетками под 20-кратным воздушным объективом или 40-кратным масляным погружным объективом.
Возбуждайте стальной краситель с помощью 546-нанометрового лазера и собирайте излучение с помощью полосового фильтра от 570 до 620 нанометров. После выбора поля визуализации и достижения идеального фокуса сделайте одно неподвижное изображение с ярким полем, трикси и флуоресцентными маркерными каналами, чтобы отметить границы нейронов. Затем запустите Run Now в программном обеспечении для сбора и выполните базальную запись в течение трех-пяти минут, чтобы исключить изменения интенсивности красителя.
Прямо при переходе ко второй фазе включите кнопку для перфузионной системы и постоянно перфьминируйте 50 миллимоляров хлорида калия в нейроны, чтобы облегчить разгрузку красителя. Выполните запись в течение пяти минут, затем включите переключатель выключения для системы перфузии. Сохраните эксперимент для последующего анализа данных с помощью конфокального программного обеспечения.
Через 48 часов после трансфекции GCaMP six M инкубируют первичные корковые нейроны грызунов с низким содержанием хлорида калия ACSF в течение 15 минут. Затем установите тарелку на платформу визуализации и визуализируйте флуоресценцию GCaMP six M с помощью фильтра Fitzy и объектива 20 или 40 раз. После выбора поля визуализации и достижения идеального фокуса сделайте одно неподвижное изображение с каналами маркеров brightfield, Fitzy и флуоресцентных маркеров, чтобы отметить границы нейронов.
Затем запустите Run Now в программном обеспечении для сбора и выполните базальную запись в течение трех-пяти минут. Затем перфузируйте ACSF, содержащий 50 миллимоляров хлорида калия, к нейронам, как было продемонстрировано ранее, и записывайте в течение пяти минут. Когда получение изображения прекратится, сохраните эксперимент и приступайте к анализу данных с помощью конфокального программного обеспечения.
Для анализа изображений откройте изображения с замедленной съемкой в конфокальном программном обеспечении и выровняйте изображения, щелкнув «Изображение», затем обработайте, затем выровняйте текущий документ, затем выберите «Выровнять по первому кадру». Выберите интересующие области вдоль нейритов с помощью инструмента выбора ROI, а также отметьте ROI, представляющую интенсивность фоновой флуоресценции. Затем инициируйте функцию измерения с панели измерения времени для измерения необработанной флуоресценции с течением времени для выбранных ROI.
После измерения экспортируйте необработанные интенсивности флуоресценции в программное обеспечение для работы с электронными таблицами. Здесь показаны культивируемые первичные корковые нейроны крыс, нагруженные стириловым красителем. Специфичность загрузки красителя определяли путем совместной маркировки синаптическим везикулярным маркером синаптофизина, и большинство стерильных краситель-положительных пункт являются соположительными для этого маркера.
Анализ необработанных значений интенсивности за весь период визуализации показывает, что синаптофизин и интенсивность остаются постоянными, в то время как интенсивность стирилового красителя снижается после стимуляции. Для зеленых флуоресцентных белковых трансфектированных контрольных нейронов успешное высвобождение синаптических пузырьков привело к поразительной потере флуоресценции красителя при высокой деполяризации хлорида калия. Это репрезентативное видео показывает, как нейрон избирательно разгружает стириловый краситель в новой правой области после стимуляции.
Напротив, в нейронах, трансфектированных C девятью ORF 72, связанными с конструкцией повтора пептида красителя с GA 50, нарушение синаптической передачи представлено сохраненной флуоресценцией красителя даже после высокой деполяризации хлорида калия. Репрезентативные флуоресцентные изображения корковых нейронов, трансфектированных GCaMP шесть M до и после деполяризации хлорида калия, показаны здесь. Повышенные значения флуоресценции и корковые нейроны, трансфектированные GCaMP six M, указывают на поступление кальция в нейриты после индуцированной деполяризации хлорида калия.
В конце исходного периода записи нейроны экспрессировали GCaMP шесть M с низкой флуоресценцией. Затем в начале стимуляции наблюдается резкое увеличение флуоресценции. Убедитесь, что базовые записи флуоресценции для стирилового красителя и GCaMP стабильны.
Всегда используйте идеальную фокусировку, чтобы избежать дрейфа изображения, что усложнит обработку данных после изображения. Дальнейшее культивирование нейронов не рекомендуется, так как посуда подвергается воздействию воздуха во время изобилия. Однако иммуноокрасление или экстракция белка или РНК может оценить потенциальные причины синаптических изменений.
