برنامج الحصول الآلي على البيانات ضروري للغاية لجمع كمية هائلة من البيانات cryo لتوصيف الهيكلية لل macromoleculess البيولوجية. تم استخدام حزمة برامج الحصول الآلي على البيانات هنا لتوصيف بنية مختلف الماكروموليكوليس البيولوجية ، والتي ترتبط مباشرة مع بيولوجيا مسببات الأمراض. على سبيل المثال، البكتيريا الفطرية وفيروس نقص المناعة البشرية وSASCO 2.
لتبدأ ، بدء خط العرض - S برنامج الحصول على البيانات الآلية من خلال النقر على DigitalMicrograph من قائمة البداية. بعد ذلك، حدد إدارة التقنيات، ثم رمز Latitude-S لجمع البيانات التلقائية أحادية الجسيمات. لإنشاء جلسة عمل استنادا إلى إعدادات جلسة العمل السابقة، حدد خانة الاختيار استنادا إلى جلسة العمل السابقة في لوح الألوان، ثم حدد الزر الجديد أو لمتابعة جلسة عمل موجودة، اضغط على زر المتابعة.
لبدء جلسة عمل جديدة تماما، انقر على علامة التبويب الجديدة في لوحة الألوان. اختر المجلد الذي يحتوي على جلسة العمل التي سيتم المتابعة وحدد المجلد لحفظ البيانات. بعد ذلك، انقر فوق رمز الإعداد وفي مربع استكشاف الحالة المدارة الذي يظهر، وإضافة الحالة، وتعيين شرط TEM، وحالة الكاميرا، والصورة أو خيار المخزون.
ثم قم بتسمية الحالة أو افتح ملخص إعداد الحالة لفتح إعدادات الحفظ. بعد ذلك، قم بتكوين حالة أطلس بالنقر فوق لوحة حالة أطلس وتعيين معلمات التكبير وظروف الإضاءة ووقت تعرض الكاميرا، وانقر فوق التالي للانتقال إلى الحالة التالية. ثم قم بتكوين حالة الشبكة بالنقر على لوحة حالة الشبكة، ثم قم بتعيين معلمات بصريات التصوير بالمجهر وظروف الإضاءة ووقت تعرض الكاميرا، وانقر على التالي.
تكوين حالة ثقب عن طريق النقر على لوحة حفرة وتعيين البصريات التصوير، وظروف الإضاءة، binning والمعلمات الوقت التعرض الكاميرا. بعد النقر على التالي، قم بتكوين حالة التركيز التالية بالنقر على لوحة التركيز وتعيين إعدادات المجهر للتصوير البصريات وظروف الإضاءة ووقت التعرض للكاميرا. ثم ركز على منطقة الكربون غير المتبلورة بالقرب من الحفرة وانقر بجوار للانتقال إلى الحالة التالية.
تكوين حالة البيانات عن طريق النقر على لوحة البيانات وتعيين المعلمات لإعدادات المجهر، ثم انقر على التالي. انقر على لوحة تكوين التركيز لتحديد نطاق قيم defocus وحجم الخطوة في علامة التبويب المحددة واضغط على الزر التالي للانتقال إلى الخطوة التالية. التركيز على الميزات المطلوبة على الشبكة وانقر على زر التقاط.
ثم ضع علامة الصليب الأحمر على نفس الميزة على كل صورة من حالات مختلفة. ابدأ بحالات التركيز والبيانات والثقب، لأن مجال الرؤية أكبر من حالات أطلس والشبكة. بعد ذلك، قم بتكبير حالات Atlas و Grid لوضع علامة الصليب الأحمر على نفس الميزة.
لحساب المواضع والإزاحة بين كل حالة من الحالات الخمس المختلفة وعكس المواضع والإزاحات إلى إطار الإخراج، انقر فوق زر الحساب. انقر على لوحة التقاط واختيار حجم أطلس لتغطية الشبكة بأكملها أو جزء من الشبكة على أساس الشرط. لالتقاط الأطلس، انتقل على الأطلس وحدد مربع الشبكة استنادا إلى سمك الجليد.
بمجرد تحديد مربعات الشبكة المطلوبة ، انقر على زر الجدول الزمني ولاحظ المربعات في مربع الشبكة تملأ كما يتم التقاط كل مربع الشبكة. بمجرد النقر فوق الزر الجدولة حدد ثقب تمثيلي في مربع الشبكة عن طريق إضافة موضع الفتحة. بمجرد الحصول على صورة الثقب، حدد البيانات ومواضع التركيز واحفظ التخطيط كقالب.
انقر على البحث التلقائي، أدخل حجم الحفرة، وانقر على زر البحث في البرنامج للعثور تلقائيا على الثقوب على أساس القطر. إعداد كثافة لإزالة الثقوب من مربع الشبكة وتلوث الجليد. وبعد إضافة أدوات العلامة المحددة والصفراء من خلال البحث التلقائي ، انقر على زر الجدولة في مهام خط العرض.
ووفقا للفحص اليدوي الأولي للصور الدقيقة المصححة للحركة باستخدام برنامج cisTEM، تبين أن معظم البيانات تقع ضمن نطاق الإشارة المطلوب. بالإضافة إلى ذلك ، تم فحص الصور التي تم جمعها في نطاقات defocus ، يدويا من قبل cisTEM. تم اختيار جزيئات الارتفاع يدويا لحساب متوسطات الفئة 2D للتصور الهيكلي ، مما اقترح بقوة ، ولكن كان من الممكن تحديد توصيف هيكلي عالي الدقة باستخدام مجموعة البيانات المعنية.
وأشار تصنيف 3D أن سبايك بروتين لديه 1RBD في تأكيد مفتوح وجميع RBD أخرى في أسفل تأكيد وثيق. تم إعادة بناء 1RBD حتى تأكيدات مفتوحة من بروتين سبايك باستخدام التماثل C1. يتم تمثيل خريطة بروتين سبايك في وجهات النظر العلوية والسفلية الجانبية.
وخريطة EM مزودة ببنية ذرية لتصور أفضل للسلاسل الجانبية. تم تحسين تأكيدات إغلاق RBD أسفل مع التماثل C3 والنموذج المكرر 3D ارتفاع وخريطة EM، مزودة بنية ذرية كما هو مبين. وأكد وسيطة من بروتين سبايك التي تم تحديدها على أنها المجال الفرعي S2 أشار إلى السلاسل الجانبية لمخلفات الأحماض الأمينية الفردية.
وتشير النتائج إلى أن خط العرض-S يمكن أن يجمع بيانات عالية الدقة من الجزيئات الكبيرة البيولوجية. يمكن استخدام برنامج جمع البيانات الآلي هذا لأي نظام مجهر إلكتروني آخر لجمع البيانات تلقائيا.
