Le logiciel d’acquisition de données automatisé est extrêmement nécessaire pour collecter une énorme quantité de données cryogéniques pour la caractérisation structurelle des macromolécules biologiques. Le progiciel d’acquisition automatisée de données a été utilisé ici pour caractériser la structure de diverses macromolécules biologiques, qui sont directement associées à la biologie des agents pathogènes. Par exemple, mycobacterium, VIH et SASCO 2.
Pour commencer, démarrez le logiciel d’acquisition de données automatisée Latitude-S en cliquant sur DigitalMicrograph dans le menu Démarrer. Ensuite, sélectionnez le Gestionnaire technique, puis l’icône Latitude-S pour La collecte automatisée de données à particule unique. Pour créer une session basée sur les paramètres de session précédente, cochez la case basée sur la session précédente dans la palette, puis sélectionnez le nouveau bouton ou pour continuer une session existante, appuyez sur le bouton Continuer.
Pour démarrer une toute nouvelle session, cliquez sur le nouvel onglet de la palette. Choisissez le dossier contenant la session à poursuivre et sélectionnez le dossier pour enregistrer les données. Ensuite, cliquez sur l’icône de réglage et dans la zone d’exploration de l’état géré qui apparaît, ajoutez l’état, définissez la condition TEM, l’état de la caméra et l’option d’image ou d’action.
Et puis, nommez l’état ou ouvrez le résumé de la configuration de l’état pour ouvrir les paramètres d’enregistrement. Ensuite, configurez l’état Atlas en cliquant sur la palette d’états Atlas et définissez les paramètres de grossissement, de conditions d’éclairage et de temps d’exposition de l’appareil photo, puis cliquez sur Suivant pour passer à l’état suivant. Configurez ensuite l’état de la grille en cliquant sur la palette d’état de la grille, définissez les paramètres de l’optique d’imagerie du microscope, des conditions d’éclairage et du temps d’exposition de l’appareil photo, puis cliquez sur Suivant.
Configurez l’état du trou en cliquant sur la palette de trous et définissez les paramètres d’optique d’imagerie, les conditions d’éclairage, le binning et le temps d’exposition de l’appareil photo. Après avoir cliqué sur suivant, configurez l’état de mise au point suivant en cliquant sur la palette de mise au point et définissez les paramètres du microscope pour l’optique d’imagerie, les conditions d’éclairage, le binning et le temps d’exposition de l’appareil photo. Concentrez-vous ensuite sur la zone de carbone amorphe près du trou et cliquez sur suivant pour passer à l’état suivant.
Configurez l’état des données en cliquant sur la palette de données et définissez les paramètres des paramètres du microscope, puis cliquez sur suivant. Cliquez sur la palette de configuration du focus en spécifiant la plage de valeurs de mise au point et la taille du pas dans l’onglet donné et appuyez sur le bouton suivant pour passer à l’étape suivante. Concentrez-vous sur les fonctionnalités requises sur la grille et cliquez sur le bouton de capture.
Placez ensuite la croix rouge sur la même fonction sur chaque image d’états différents. Commencez par les états Focus, Data et Hole, car le champ de vision est plus grand que les états Atlas et Grid. Ensuite, zoomez sur les états Atlas et Grille pour positionner la croix rouge sur la même entité.
Pour calculer les positions et le décalage entre chacun des cinq états différents et refléter les positions et les décalages dans la fenêtre de sortie, cliquez sur le bouton Calculer. Cliquez sur la palette de capture et choisissez la taille de l’Atlas pour couvrir toute la grille ou une partie de la grille en fonction des besoins. Pour capturer l’Atlas, naviguez sur l’Atlas et sélectionnez le carré de la grille en fonction de l’épaisseur de la glace.
Une fois que les carrés de grille souhaités sont sélectionnés, cliquez sur le bouton de planification et observez les tuiles du carré de la grille se remplir au fur et à mesure que chaque carré de grille est capturé. Une fois le bouton de planification cliqué, sélectionnez un trou représentatif dans le carré de la grille en ajoutant la position du trou. Une fois l’image du trou acquise, définissez les positions des données et de mise au point et enregistrez la mise en page en tant que modèle.
Cliquez sur recherche automatique, entrez la taille du trou et cliquez sur le bouton de recherche dans le programme pour trouver automatiquement les trous en fonction du diamètre. Configurez l’intensité pour enlever les trous du carré de la grille et la contamination de la glace. Et après avoir ajouté les outils sélectionnés et de marque jaune via la recherche automatique, cliquez sur le bouton de planification dans les tâches latitude.
Selon le dépistage manuel initial des micrographies corrigées du mouvement à l’aide du logiciel cisTEM, la plupart des données se situaient dans la plage de signal souhaitée. De plus, les images collectées dans les plages de mise au point ont également été vérifiées manuellement par cisTEM. Les particules de pointe ont été sélectionnées manuellement pour calculer les moyennes de classe 2D pour la visualisation structurelle, ce qui suggérait fortement, mais la caractérisation structurelle à haute résolution était possible en utilisant l’ensemble de données respectif.
La classification 3D a indiqué que Spike Protein a 1RBD dans la confirmation ouverte vers le haut et tous les autres RBD dans la confirmation de fermeture vers le bas. Les confirmations ouvertes 1RBD de la protéine Spike ont été reconstruites en utilisant la symétrie C1. La carte Spike Protein est représentée dans les vues latérales supérieure et inférieure.
Et la carte EM est équipée d’une structure atomique pour une meilleure visualisation des chaînes latérales. Les confirmations de fermeture RBD ont été affinées avec la symétrie C3 et le modèle affiné 3D de pointe et la carte EM, équipés d’une structure atomique comme indiqué. Et la confirmation intermédiaire de la protéine Spike identifiée comme le sous-domaine S2 indiquait les chaînes latérales des résidus d’acides aminés individuels.
Les résultats suggèrent que Latitude-S peut collecter des données cryo EM à haute résolution de macromolécules biologiques. Ce logiciel de collecte automatisée de données pourrait être utilisé par n’importe quel autre système de microscopie électronique pour collecter des données automatiquement.
