用户友好型、高通量和全自动数据采集软件，用于单颗粒冷冻电子显微镜

自动数据采集软件对于收集大量冷冻数据以进行生物无大分子的结构表征是非常必要的。这里使用自动数据采集软件包来表征与病原体生物学直接相关的各种生物大无分子的结构。例如，分枝杆菌，HIV和SASCO 2。

首先，通过单击"开始"菜单中的数字显微图来启动Latitude-S自动数据采集软件。接下来，选择"技术管理器"，然后选择"纬度-S"图标，用于"单粒子自动数据收集"。要基于以前的会话设置创建会话，请选中调色板中的"基于以前的会话"复选框，然后选择新按钮或继续现有会话，请按"继续"按钮。

要启动全新的会话，请单击选项板中的新选项卡。选择要继续的会话的文件夹，然后选择要保存数据的文件夹。接下来，单击设置图标，然后在出现的"托管状态浏览"框中，添加状态，设置TEM条件，相机条件以及图像或库存选项。

然后，命名状态或打开状态设置摘要以打开保存设置。接下来，通过单击 Atlas 状态调色板配置 Atlas 状态，并设置放大倍率、照明条件和相机曝光时间的参数，然后单击下一步移动到下一个状态。然后通过单击网格状态调色板来配置网格状态，设置显微镜成像光学元件，照明条件和相机曝光时间的参数，然后单击下一步。

通过单击孔调色板配置孔状态，并设置成像光学元件、照明条件、分档和相机曝光时间参数。单击"下一步"后，通过单击对焦调色板配置下一个对焦状态，并设置成像光学元件、照明条件、合并和相机曝光时间的显微镜设置。然后聚焦在孔附近的无定形碳区域，然后单击"下一步"移动到下一个状态。

通过单击数据调色板配置数据状态并设置显微镜设置的参数，然后单击下一步。单击焦点配置调色板，在给定选项卡中指定散焦值的范围和步长，然后按下一步按钮进入下一步。将焦点放在网格上所需的功能上，然后单击捕获按钮。

然后将红叉标记定位在不同状态的每个图像上的同一特征上。从"焦点"、"数据"和"洞"状态开始，因为视野大于"图集"和"网格"状态。接下来，缩放地图集和格网状态以将红叉标记定位在同一要素上。

要计算五种不同状态之间的位置和偏移，并将位置和偏移量反映到输出窗口中，请单击计算按钮。单击捕获调色板，然后根据要求选择 Atlas 的大小以覆盖整个网格或部分网格。要捕获地图集，请在地图集上进行导航，然后根据冰的厚度选择网格正方形。

选择所需的网格方块后，单击计划按钮，并在捕获每个网格方块时观察网格方块中的磁贴填满。单击计划按钮后，通过添加孔的位置在网格正方形中选择一个具有代表性的孔。获取孔图像后，定义数据和焦点位置，并将布局另存为模板。

单击"自动查找"，输入孔大小，然后单击程序中的"查找"按钮以根据直径自动查找孔。设置强度以从网格方块和冰污染中移除孔。通过自动查找添加所选和黄色标记工具后，单击纬度任务中的计划按钮。

根据使用cisTEM软件对运动校正显微照片的初始手动筛选，发现大多数数据都在所需的信号范围内。此外，在散焦范围内收集的图像也通过cisTEM手动检查。手动选择尖峰颗粒以计算结构可视化的2D类平均值，这强烈建议使用各自的数据集进行高分辨率结构表征。

3D分类表明，Spike蛋白在向上开盘确认中具有1RBD，在向下收盘确认中具有所有其他RBD。使用C1对称性重建了Spike蛋白的1RBD向上开放确认。尖峰蛋白图在侧面顶部和底部视图中表示。

EM图具有原子结构，可以更好地可视化侧链。RBD下行收盘确认通过C3对称性进行了细化，尖峰3D细化模型和EM图，并拟合了如图所示的原子结构。被鉴定为S2子结构域的Spike蛋白的中间确认表明单个氨基酸残基的侧链。

结果表明，Latitude-S可以收集生物大分子的高分辨率冷冻电镜数据。该自动数据收集软件可用于任何其他电子显微镜系统以自动收集数据。