自動データ収集ソフトウェアは、生物学的高分子の構造特性を得るための膨大な量のクライオデータを収集するために非常に必要です。ここでは、自動データ取得ソフトウェアパッケージを使用して、病原体生物学に直接関連する様々な生体高分子の構造を特徴付けます。例えば、マイコバクテリウム、HIVおよびSASCO 2。
まず、スタートメニューからDigitalMicrographをクリックして、Latitude-S自動データ収集ソフトウェアを起動します。次に、テクニック マネージャを選択し、単一パーティクル自動データ収集の Latitude-S アイコンを選択します。前のセッション設定に基づいてセッションを作成するには、パレットの前のセッションチェックボックスをオンにして、新しいボタンを選択するか、既存のセッションを続行するには、続行ボタンを押します。
まったく新しいセッションを開始するには、パレットの新しいタブをクリックします。継続するセッションを含むフォルダを選択し、データを保存するフォルダを選択します。次に、設定アイコンをクリックし、表示される管理状態の探索ボックスで、状態を追加し、TEM 条件、カメラの状態、および画像またはストック オプションを設定します。
状態に名前を付けるか、状態設定の概要を開いて保存設定を開きます。次に、アトラス状態パレットをクリックしてアトラス状態を設定し、拡大率、照明条件、カメラ露出時間のパラメータを設定し、[次の状態に移動する]をクリックします。次に、グリッド状態パレットをクリックしてグリッド状態を設定し、顕微鏡イメージング光学、照明条件、カメラ露出時間のパラメータを設定し、[次へ]をクリックします。
穴パレットをクリックして穴の状態を設定し、イメージング光学、照明条件、ビニング、カメラ露出時間パラメータを設定します。次にクリックした後、フォーカスパレットをクリックして次のフォーカス状態を設定し、光学、照明条件、ビニング、カメラ露出時間の顕微鏡設定を行います。次に、穴の近くのアモルファスカーボン領域に焦点を合わせ、次の状態に移動するために次をクリックします。
データパレットをクリックしてデータ状態を設定し、顕微鏡設定のパラメータを設定してから、[次へ]をクリックします。フォーカス解除値の範囲と指定したタブのステップサイズを指定してフォーカス構成パレットをクリックし、次のボタンを押して次のステップに進みます。グリッド上の必要な機能に焦点を当てて、キャプチャ ボタンをクリックします。
次に、異なる状態の各画像上の同じフィーチャに赤い十字マークを配置します。視野がアトラスおよびグリッドの状態よりも大きいため、フォーカス、データ、ホールの状態から開始します。次に、アトラスとグリッドの状態を拡大して、同じフィーチャに赤い十字マークを配置します。
5 つの異なる状態の間の位置とオフセットを計算し、出力ウィンドウに位置とオフセットを反映するには、計算ボタンをクリックします。キャプチャ パレットをクリックし、要件に基づいてグリッド全体またはグリッドの一部をカバーする Atlas のサイズを選択します。アトラスをキャプチャするには、アトラス上を移動し、氷の厚さに基づいてグリッドの正方形を選択します。
目的のグリッド四角形を選択したら、スケジュール ボタンをクリックし、グリッドの正方形がキャプチャされるごとに、グリッドの正方形のタイルがいっぱいに表示されます。集計ボタンをクリックしたら、穴の位置を追加して、グリッドの正方形の代表穴を選択します。穴のイメージが取得されたら、データとフォーカス位置を定義し、テンプレートとしてレイアウトを保存します。
自動検索をクリックし、穴のサイズを入力し、自動的に直径に基づいて穴を見つけるためにプログラムで検索ボタンをクリックします。グリッドの正方形と氷の汚染から穴を除去するために強度を設定します。そして、自動検索を介して選択され、黄色のマークツールを追加した後、緯度タスクのスケジュールボタンをクリックします。
cisTEMソフトウェアを用いたマイクログラフを修正したモーションの初期手動スクリーニングに従って、データのほとんどは所望の信号範囲内にあることが判明した。また、デフォーカス範囲で収集された画像も、cisTEMによって手動でチェックした。スパイク粒子は手動で選択して構造ビジュアライゼーションの 2D クラス平均を計算しましたが、これは強く示唆されましたが、それぞれのデータセットを使用して高解像度の構造特性を考え出しました。
3D分類は、スパイクタンパク質が開いた確認で1RBDを有し、ダウンクローズ確認で他のすべてのRBDを有することを示した。スパイクタンパク質の1RBDアップオープン確認は、C1対称性を用いて再構築された。スパイクタンパク質マップは、側面の上と下のビューで表されます。
そして、EMマップは、サイドチェーンのより良い視覚化のための原子構造が取り付けられています。RBDダウンクローズ確認は、C3対称性と、図のように原子構造を取り付けたスパイク3D精製モデルとEMマップで洗練されました。S2サブドメインとして同定されたスパイクタンパク質の中間確認とは、個々のアミノ酸残基の側鎖を示した。
その結果、Latitude-Sは生体高分子の高解像度クライオEMデータを収集できることが示唆された。この自動データ収集ソフトウェアは、データを自動的に収集するために、他の電子顕微鏡システムに使用することができます。
