Автоматизированное программное обеспечение для сбора данных крайне необходимо для сбора огромного количества криозданных для структурной характеристики биологических макромолекулов. Пакет Automated Data Acquisition Software был использован здесь для характеристики структуры различных биологических макромолекулов, которые напрямую связаны с биологией патогенов. Например, микобактерии, ВИЧ и SASCO 2.
Для начала запустите программное обеспечение Latitude-S Automated Data Acquisition Software, щелкнув DigitalMicrograph в меню «Пуск». Затем выберите диспетчер техники, а затем значок Latitude-S для автоматического сбора данных по одной частице. Чтобы создать сеанс на основе параметров предыдущего сеанса, установите флажок на основе предыдущего сеанса в палитре, а затем нажмите кнопку «Новый» или, чтобы продолжить существующий сеанс, нажмите кнопку «Продолжить».
Чтобы начать совершенно новый сеанс, нажмите на новую вкладку в палитре. Выберите папку, содержащую сеанс, который необходимо продолжить, и выберите папку для сохранения данных. Затем щелкните значок настройки и в появившемся поле просмотра управляемого состояния добавьте состояние, установите условие TEM, условие камеры и параметр изображения или запаса.
Затем присвойте государству имя или откройте сводку настроек состояния, чтобы открыть параметры сохранения. Затем настройте состояние Atlas, щелкнув палитру состояния Atlas, и задайте параметры увеличения, условий освещения и времени экспозиции камеры, а затем нажмите next, чтобы перейти к следующему состоянию. Затем настройте состояние сетки, щелкнув палитру состояния сетки, установите параметры для оптики визуализации микроскопа, условия освещения и время экспозиции камеры, и нажмите «Далее».
Настройте состояние отверстия, щелкнув по палитре отверстий, и установите оптику изображения, условия освещения, биннинг и параметры времени экспозиции камеры. После нажатия кнопки «Далее» настройте следующее состояние фокусировки, щелкнув палитру фокусировки, и установите параметры микроскопа для оптики изображения, условий освещения, биннинга и времени экспозиции камеры. Затем сосредоточьтесь на аморфной углеродной области рядом с отверстием и нажмите далее, чтобы перейти к следующему состоянию.
Настройте состояние данных, щелкнув по палитре данных и задав параметры для параметров микроскопа, затем нажмите «Далее». Нажмите на палитру конфигурации фокусировки, указав диапазон значений расфокусировки и размер шага в данной вкладке, и нажмите следующую кнопку, чтобы перейти к следующему шагу. Сосредоточьтесь на необходимых функциях на сетке и нажмите кнопку захвата.
Затем поместите знак красного креста на один и тот же объект на каждом изображении разных состояний. Начните с состояний Фокус, Данные и Дыра, потому что поле зрения больше, чем состояния Атласа и Сетки. Затем увеличьте масштаб состояний Atlas и Grid, чтобы расположить красный крестик на том же объекте.
Чтобы вычислить позиции и смещение между каждым из пяти различных состояний и отразить позиции и смещения в окне вывода, нажмите кнопку вычисления. Нажмите на палитру захвата и выберите размер атласа, чтобы охватить всю сетку или часть сетки в зависимости от требования. Чтобы захватить Атлас, перейдите по Атласу и выберите квадрат сетки в зависимости от толщины льда.
После того, как нужные квадраты сетки выбраны, нажмите кнопку расписания и наблюдайте, как плитки в квадрате сетки заполняются по мере захвата каждого квадрата сетки. После нажатия кнопки расписания выберите репрезентативное отверстие в квадрате сетки, добавив положение отверстия. После получения изображения отверстия определите данные и позиции фокусировки и сохраните макет в качестве шаблона.
Нажмите на автоматический поиск, введите размер отверстия и нажмите кнопку поиска в программе, чтобы автоматически найти отверстия на основе диаметра. Установите интенсивность для удаления отверстий из сетки квадрата и загрязнения льдом. А после добавления выбранных и желтых инструментов меток через автонайс, нажмите на кнопку расписания в локаторных задачах.
В соответствии с первоначальным ручным скринингом микроснимков с коррекцией движения с использованием программного обеспечения cisTEM, большинство данных оказались в пределах желаемого диапазона сигнала. Кроме того, изображения, собранные в диапазонах расфокусировки, также были вручную проверены cisTEM. Частицы шипов были выбраны вручную для расчета средних значений 2D-класса для структурной визуализации, что настоятельно предполагалось, но структурная характеристика с высоким разрешением была возможна с использованием соответствующего набора данных.
3D-классификация показала, что Spike Protein имеет 1RBD в открытом подтверждении и все другие RBD в подтверждении закрытия. Открытые подтверждения спайкового белка 1RBD были реконструированы с использованием симметрии C1. Карта Spike Protein представлена в боковых верхних и нижних видах.
А эм-карта оснащена атомной структурой для лучшей визуализации боковых цепей. Близкие подтверждения RBD были уточнены с помощью симметрии C3 и улучшенной 3D-модели и ЭМ-карты, оснащенной атомной структурой, как показано на рисунке. А промежуточное подтверждение спайкового белка, идентифицированного как поддомен S2, указывало на боковые цепи отдельных аминокислотных остатков.
Результаты показали, что Latitude-S может собирать криоэм-данные высокого разрешения биологических макромолекул. Это автоматизированное программное обеспечение для сбора данных может быть использовано в любой другой системе электронной микроскопии для автоматического сбора данных.
