يستخدم هذا البروتوكول الكشف عن مؤشر الانكسار لقياس المنتجات الثانوية لعملية التمثيل الغذائي للكربون التي تتراكم عادة في النظم القائمة على الخلايا القائمة على اليسات. كما أنه يستخدم قياس الطيف الكتلي للكشف عن لوحة أوسع من الأيض المركزي التي يتم إنشاؤها في اليزحات النشطة الأيضية. توفر التقنيتان المستخدمتان في هذا البروتوكول القدرة على وصف التفاعلات الكيميائية التي تحدث في نظام قائم على الخلايا قائم على الليات ، مما يجعل من الممكن اكتشاف مجموعة أوسع من الأيض ، بما في ذلك تلك الموجودة بتركيزات منخفضة في خلفية التسح المعقدة.
وسيدلل على هذه الإجراءات خايمي لورنزو دينغلاسان وديفيد ريفز، الباحثان الخريجان من شعبة العلوم البيولوجية. ابدأ بالجمع بين المكونات المختلفة في أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 ملليلتر لإعداد ردود الفعل النهائية مع 4.5 ملليغرام لكل ملليلتر من البروتين الكلي لليسات. إعداد الهندسة الأيضية الخالية من الخلايا ، أو CFME ، ردود الفعل مع المجلدات النهائية من 50 ميكرولتر في ثلاثية في كل نقطة زمنية.
إنهاء ردود الفعل ثلاثية المستويات في النقاط الزمنية المناسبة على الفور بإضافة حجم متساو من حمض ثلاثي الكلور 5٪ إلى حجم التفاعل النهائي لكل عينة. ثم تمييع كل عينة بإضافة ضعف حجم الماء العقيم إلى كل خليط رد فعل. لتلخيص الوقت صفر، مزيج نفس حجم حمض ثلاثي الكلور 5٪ مثل حجم التفاعل النهائي الكلي مع lysate قبل إضافة بقية مكونات التفاعل.
هذه الخطوة التحمض يعجل الانزيمات ليسات قبل أن استقلاب الجلوكوز بشكل كبير. دوامة العينات والطرد المركزي على جهاز الطرد المركزي على مقاعد البدلاء في 11, 600 مرة ز لمدة خمس دقائق, ونقل النافورات التي تحتوي على التحليلات العضوية لتنظيف الأنابيب. تخزين العينات في ناقص 20 درجة مئوية إذا كان تحليل HPLC أن تجرى في وقت لاحق.
تأكد من إذابة العينات المخزنة على الجليد قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. تصفية كل supernatant مع مرشح المسام 0.22 ميكرومتر. بعد الطرد المركزي، نقل كل filtrate إلى قارورة زجاجية HPLC نظيفة.
قم بتحميل القنينات على درج الطوابع التلقائية لنظام HPLC الذي تم إعداده للتحليل بالفعل. من شريط القوائم، حدد التسلسل، قالب تسلسل جديد. حدد التسلسل.
حفظ قالب التسلسل كاسم قالب تسلسل S.Select تسلسل، جدول تسلسل. إلحاق N الصفوف المقابلة لقوارير N. ثم وضع قارورة الإدخال وأسماء العينة تحت اسم القارورة والعينة ، على التوالي ، وفقا لترتيبها على صينية autosampler.
حدد الطريقة التي تم إنشاؤها كما هو موضح في المخطوطة من القائمة المنسدلة اسم الأسلوب، وإدخال 50 ميكرولتر كقنين لكل قارورة لكل صف. انقر فوق تطبيق، واحفظ قالب التسلسل بتحديد التسلسل، حفظ قالب التسلسل. تأكد من تحميل قالب التسلسل عن طريق تحديد تسلسل، تحميل قالب تسلسل، تسلسل قالب اسم S.After تحقيق خط أساس مستقر على مؤامرة على الانترنت، انقر بزر الماوس الأيمن على لوحة RID الوحدة، التحكم، إيقاف إعادة تدوير صمام لتوجيه تدفق المذيبات من خلال كاشف RID إلى النفايات.
لبدء اكتساب البيانات، حدد التسلسل من شريط القوائم، ثم حدد جدول التسلسل، تشغيل. حدد طريقة عرض تحليل البيانات من القائمة عرض. حدد موقع اسم ملف التسلسل من قائمة الملفات على الجانب الأيسر من الشاشة.
على اللوحة المركزية على الشاشة، انتقل إلى تحديد عرض الإشارة، إشارة RID لعرض عينات الكروماتوجرامات. حدد صفا مطابقا لأي من العينات من اللوحة العلوية على الشاشة. سيتم ترتيب القمم المقابلة للناقصة المستهدفة على طول محور وقت الاحتفاظ مثل الجلوكوز ، النجدة ، اللاكتات ، الفورمات ، خلات ، والإيثانول في العينات التي تتواجد فيها جميع هذه الأيضات.
تمييز ما إذا كانت القمم من الاهتمام يتم دمجها بشكل جيد من قبل البرنامج. يجب رسم خط أحمر تلقائيا كقاعدة لكل قمة. إذا كان الخط الأحمر هو askew، فشل التكامل التلقائي.
ثم حدد الزر التكامل اليدوي من مجموعة أدوات التكامل، وارسم قاعدة الذروة يدويا لدمج منطقة الذروة. حدد أداة Cursor من مجموعة الأدوات المشتركة للنقر على القمم المتكاملة بشكل صحيح. سيتم تمييز منطقة الذروة ووقت رد الفعل المقابل للذروة المحددة كصف جدول على اللوحة السفلية خارج الشاشة.
لتصدير مناطق الذروة، حدد ملف، تصدير، نتائج التكامل. قيم منطقة ذروة الرسم مقابل التركيزات المعروفة للعينات في جدول بيانات. انقر بزر الماوس الأيمن فوق البيانات المرسومة، ثم حدد إضافة خط الاتجاه، تنسيق خط الاتجاه، عرض المعادلة على الرسم البياني.
في جدول بيانات منفصل، استخدم معادلات خطوط الاتجاه القياسية للمنحنى لتحويل قيم منطقة الذروة إلى تركيزات لكل تحليل من كل عينة. حساب متوسط مناطق الذروة وقيم الخطأ القياسية عبر ثلاث نسخ لتصور البيانات. إعداد ردود الفعل ثلاثية الخطوط لكل نقطة زمنية، باستثناء الوقت صفر، على الجليد كما هو موضح في المخطوطة.
بدلا من الجلوكوز، استخدم تركيز نهائي من الجلوكوز 100 ملليمولار-13C6 في ردود الفعل. احتضان ردود الفعل في 37 درجة مئوية لمدة ساعة وسنتين وثلاث ساعات. لتبدأ مع التحليل، ماصة حجم يعادل المذيبات استخراج لكل عينة.
إذا تم تجميد العينات، إضافة المذيبات استخراج قبل العينات ذوبان تماما لمنع إعادة تنشيط التمثيل الغذائي الجلوكوز. تنفيذ كافة خطوات معالجة العينة على الجليد. لتلخيص الوقت صفر، ماصة الحجم النهائي للمذيبات استخراج إلى حجم مناسب من ليسات للتركيز النهائي المطلوب من 4.5 ملليغرام لكل ملليلتر في 50 ميكرولتر من حجم رد الفعل.
إضافة بقية مكونات رد الفعل كما هو موضح سابقا. هذه الخطوة التحمض يعجل الانزيمات ليسات قبل أن استقلاب الجلوكوز بشكل كبير. احتضان العينات في استخراج المذيبات على الجليد لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز لطيف.
ثم طرد العينات في 21، 000 مرة ز لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية لفصل supernatant من البروتين عجلت. نقل 50 ميكرولتر من supernatant إلى قوارير autosampler، وتحميل قوارير على صينية داخل autosampler أربع درجات مئوية. بعد إعداد الأداة للتحليل، قم بإعداد تسلسل تشغيل باستخدام برنامج الحصول على البيانات والتفسير الخاص بنظام LC-MS/MS.
ضمن خريطة الطريق، إعداد التسلسل، انقر بزر الماوس الأيمن فوق الجدول لإدراج صفوف كثيرة مثل العينات. لكل صف، قم بتعيين حجم الحقن إلى خمسة ميكرولترات والموضع إلى موضع القارورة المعني على صينية الطوابع التلقائية. إدخال أسماء الملفات كأسماء نماذج وتعيين مسار الملف المطلوب لنتائج التشغيل.
لبدء التشغيل، قم بتمييز كافة أسماء الملفات في التسلسل. من شريط القوائم، حدد الإجراءات، تشغيل التسلسل. فتح MZmine واستيراد ملفات الإخراج الخام التي تم الحصول عليها مسبقا.
من شريط القوائم، حدد أساليب البيانات الخام، استيراد البيانات الخام، وحدد الملفات المقابلة للعينات. اتبع الخطوات الموضحة في المخطوطة لإكمال تحليل MZmine. تصدير مناطق الذروة الخام في نهاية تحليل MZmine كملف CSV.
افتح جدول بيانات لحساب كتل الأيض المسمى 13C من استقلاب الجلوكوز للبحث المستهدف. استخدام الجماهير المحسوبة من المستقلبات 13C المسمى للبحث والتعليق على ميزات الشامل إلى تهمة من نتائج MZmine. تحقق يدويا من أطياف التعليقات التوضيحية المفترضة على متصفح الجودة لتأكيد التعليقات التوضيحية.
فتح خارطة الطريق، متصفح كوال. من شريط الأدوات، افتح ملفا خاما لاستيراد بيانات MS الأولية لكل عينة. رسم خط تحت النطاق المطلوب من أوقات الاحتفاظ المقابلة للتعليق التوضيحي المفترض على مجموع الكروماتوغرام الأيونية لعرض طيف الكتلة.
في تجارب HPLC-RID ، تم استهلاك الجلوكوز في غضون الساعات الثلاث الأولى من التفاعل وتم تخميره بشكل رئيسي إلى اللاكتات. كما حدث تراكم الإيثانول بشكل كبير خلال الساعات الثلاث الأولى من التفاعل وتوقف بعد ذلك. كانت خلات موجودة في البداية في ردود الفعل كعنصر من العازلة S30 وتراكمت فقط بسبب التمثيل الغذائي بعد ست ساعات، عندما تباطأ استهلاك الجلوكوز.
وبالتالي يمكن اعتبار اللاكتات والإيثانول كالمنتجات النهائية الرئيسية للتخمير في عملية التمثيل الغذائي للجلوكوز الخالية من الخلايا والقائمة على الليكات. ولوحظ أن كلا من الفورمات والنجدة تم تصنيعها كمنتجات تخمير طفيفة. تم استهلاك الجلوكوز-13C6 بشكل ملحوظ من خلال انحلال الجليكوليسيس، كما يتضح من التقلبات في الوسيطات الجليكوليكية.
بما يتفق مع بيانات الكشف عن مؤشر الانكسار HPLC، تراكمت الجلوكوز إلى اللاكتات-13C3 وتم تخميرها أيضا إلى succinate-13C3 في غضون الساعات الثلاث الأولى من رد الفعل. كما لوحظ دمج الكربونات المشتقة من الجلوكوز-13C6 في فوسفات السكر 6-فوسفوجلوكولاتون و6-فوسفوجلوكونات والريبلوز-5-فوسفات وsedoheptulose-7-الفوسفات مما يؤكد مشاركة مسار فوسفات البنتوس في عملية التمثيل الغذائي للجلوكوز ليسات. تم العثور على استقلاب الجلوكوز ليسات لتغذية التيروزين-13C9 التوليف, في حين توفر أيضا مقدمة لإنتاج الهستيدين-13C5.
من المهم أن تمثل عينات التحكم الوقت صفر بدقة. لذلك، تأكد من أن البروتينات في اللستات معطلة قبل خلط في الحل الذي يحتوي على مصادر الطاقة. تأكد أيضا من أن التكامل التلقائي للقمم من عينات الاختبار وعينات التحكم والمعايير متسق أيضا ، بحيث تكون مناطق الذروة المستخرجة قابلة للمقارنة.
