Este protocolo usa a detecção de índices refrativos para medir subprodutos do metabolismo de carbono que são comumente acumulados em sistemas sem células baseados em lysato. Ele também faz uso de espectrometria de massa para detectar um painel ainda mais amplo de metabólitos centrais que são gerados em lisatos metabolicamente ativos. As duas técnicas utilizadas neste protocolo fornecem a capacidade de descrever quantitativamente as reações químicas ocorridas em um sistema sem células, com base em lisesto, possibilitando detectar uma gama mais ampla de metabólitos, incluindo aqueles presentes em baixas concentrações no complexo fundo lysate.
Os procedimentos serão Jaime Lorenzo Dinglasan e David Reeves, pesquisadores graduados da Divisão de Biociências. Comece combinando os diferentes componentes em tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro para preparar reações finais com 4,5 miligramas por mililitro de proteína total de liseto. Prepare a engenharia metabólica livre de células, ou CFME, reações com volumes finais de 50 microliters em triplicado por ponto de tempo.
Termine as reações triplicadas em seus pontos de tempo apropriados imediatamente adicionando um volume igual de ácido tricloroacético de 5% ao volume final de reação de cada amostra. Em seguida, diluir cada amostra adicionando duas vezes o volume de água estéril a cada mistura de reação. Para recapitular o tempo zero, misture o mesmo volume de ácido tricloroacético de 5% como o volume total de reação final com o lisato antes de adicionar o resto dos componentes de reação.
Esta etapa de acidificação precipita enzimas lisato antes de metabolizar significativamente a glicose. Vórtice as amostras e centrífugas em uma microcentrifuagem benchtop a 11.600 vezes g por cinco minutos, e transfira os supernacantes contendo os analitos orgânicos para tubos limpos. Armazene as amostras a menos 20 graus Celsius se as análises do HPLC forem realizadas mais tarde.
Certifique-se de descongelar as amostras armazenadas no gelo antes de prosseguir para o próximo passo. Filtre cada supernante com um filtro de poros de 0,22 micrômetro. Após a centrífuga, transfira cada filtrado para um frasco de vidro HPLC limpo.
Carregue os frascos na bandeja do autosampler do sistema HPLC que já foi configurado para análise. Na barra de menu, selecione Sequência, Novo Modelo de Sequência. Selecione Sequência.
Salvar o modelo de sequência como nome de modelo de sequência S.Selecionar sequência, tabela de sequência. Linhas de apêndice N correspondentes aos frascos N. Em seguida, insira posições de frasco e nomes de amostra sob frasco e nome da amostra, respectivamente, de acordo com seu arranjo na bandeja do autosampler.
Selecione o método gerado como descrito no manuscrito do menu suspenso Method Name e insira 50 microliters como injeção por frasco para cada linha. Clique em Aplicar e salvar o modelo de sequência selecionando Sequência, Modelo de sequência. Certifique-se de que o modelo de sequência seja carregado selecionando sequência, modelo de sequência, nome do modelo de sequência S.Depois de alcançar uma linha de base estável no plot on-line, clique com o botão direito do mouse no módulo RID do painel, controle, válvula de reciclagem para direcionar o fluxo de solventes através do detector RID para o lixo.
Para iniciar a aquisição de dados, selecione Sequência na barra de menu e selecione Tabela de sequência, Executar. Selecione a exibição de análise de dados no menu Exibir. Localize o nome do arquivo de sequência da lista de arquivos no lado esquerdo da tela.
No painel central na tela, vá para a Seleção de exibição de sinal, SINAL RID para visualizar os cromatogramas de amostra. Selecione uma linha correspondente a qualquer uma das amostras do painel superior na tela. Os picos correspondentes aos analitos alvo serão organizados ao longo do eixo do tempo de retenção como glicose, succinato, lactato, formate, acetato e etanol em amostras onde todos esses metabólitos estão presentes.
Discerna se os picos de interesse estão bem integrados pelo software. Uma linha vermelha deve ser automaticamente desenhada como base de cada pico. Se a linha vermelha for askew, a integração automática falhou.
Em seguida, selecione o botão Integração Manual no Conjunto de Ferramentas de Integração e desenhe manualmente uma base de pico para integrar a área de pico. Selecione a ferramenta Cursor no Conjunto de Ferramentas Comuns para clicar em picos devidamente integrados. A área de pico e o tempo de reação correspondente do pico selecionado serão destacados como uma linha de mesa no painel inferior da tela.
Para exportar áreas de pico, selecione Arquivo, Exportação, Resultados de Integração. Valores de área de pico de gráfico versus concentrações conhecidas de amostras em uma planilha. Clique com o botão direito do mouse nos dados plotados e selecione Adicionar linha de tendência, linha de tendência de formato, exibir equação no gráfico.
Em uma planilha separada, use as equações das linhas de tendência de curva padrão para converter valores de área de pico em concentrações para cada analito de cada amostra. Calcule as áreas de pico média e os valores de erro padrão entre os triplicados para visualização de dados. Configure reações triplicadas por ponto de tempo, exceto o tempo zero, no gelo, conforme descrito no manuscrito.
Em vez de glicose, use uma concentração final de glicose de 100 milimões-13C6 nas reações. Incubar as reações a 37 graus Celsius por uma, duas e três horas. Para começar com a análise, pipeta um volume equivalente do solvente de extração para cada amostra.
Se as amostras foram congeladas, adicione o solvente de extração antes que as amostras descongelem completamente para evitar a reativação do metabolismo da glicose. Realize todas as etapas de processamento de amostras no gelo. Para recapitular o tempo zero, pipeta o volume final de solvente de extração a um volume apropriado de lise para a concentração final desejada de 4,5 miligramas por mililitro em 50 microlitradores de volume de reação.
Adicione o resto dos componentes de reação conforme descrito anteriormente. Esta etapa de acidificação precipita enzimas lisato antes de metabolizar significativamente a glicose. Incubar as amostras em solvente de extração no gelo por 30 minutos com agitação suave.
Em seguida, centrifugar as amostras a 21.000 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius para separar o sobrenante da proteína precipitada. Transfira 50 microlitadores do supernatante para frascos de automapeador e carregue os frascos na bandeja dentro do autosampler de quatro graus Celsius. Após a preparação do instrumento para análise, configure uma sequência de execução usando o software de aquisição e interpretação de dados do sistema LC-MS/MS.
Dentro do Roteiro, Configuração de sequência, clique com o botão direito do mouse na tabela para inserir tantas linhas quanto amostras. Para cada linha, ajuste o volume de injeção para cinco microlitrais e a posição para a respectiva posição do frasco na bandeja do autosampler. Insira nomes de arquivos como nomes de exemplo e defina o caminho de arquivo desejado para obter resultados de execução.
Para iniciar a execução, destaque todos os nomes de arquivos na sequência. Na barra de menu, selecione Ações, Executar sequência. Abra mzmine, e importe os arquivos de saída bruto obtidos anteriormente.
Na barra de menu, selecione Métodos de Dados Brutos, Importação bruta de dados e selecione os arquivos correspondentes às amostras. Siga os passos descritos no manuscrito para concluir a análise de MZmine. Exporte as áreas de pico bruto no final da análise de MZmine como um arquivo CSV.
Abra uma planilha para calcular as massas de metabólitos rotulados em 13C do metabolismo da glicose para a pesquisa direcionada. Use massas calculadas de metabólitos com etiqueta 13C para pesquisar e anotar recursos de massa para carga a partir dos resultados do MZmine. Verifique manualmente os espectros das anotações putativas em um navegador de qualidade para confirmar as anotações.
Mapa de estrada aberto, Qual Browser. A partir da barra de ferramentas, abra arquivo bruto para importar dados de MS brutos de cada amostra. Desenhe uma linha sob a faixa desejada de tempos de retenção correspondente à anotação putativa no cromatágrama de íon total para visualizar um espectro de massa.
Nos experimentos HPLC-RID, a glicose foi consumida nas primeiras três horas da reação e, principalmente, fermentada ao lactato. O acúmulo de etanol também ocorreu significativamente nas primeiras três horas da reação e parou depois disso. O acetato estava inicialmente presente nas reações como um componente do tampão S30 e só se acumulou devido ao metabolismo após seis horas, quando o consumo de glicose havia desacelerado.
O lactato e o etanol podem, portanto, ser considerados como os principais produtos finais de fermentação no metabolismo de glicose à base de lysato e livre de células. Observou-se que tanto o formate quanto o succinato foram sintetizados como produtos de fermentação menores. A glicose-13C6 foi consumida observamente através da glicólise, como evidente pelas flutuações em intermediários glicógliticos.
Consistente com os dados de detecção do índice de refração HPLC, a glicose acumulou-13C3 e também foi fermentada para succinato-13C3 nas primeiras três horas da reação. Também foi observada a incorporação de carbonos derivados de glicose-13C6 em fosfatos de açúcar 6-fosfogluconolactona, 6-fosfogluconato, ribulose-5-fosfato e sedoheptulose-7-fosfato, confirmando a participação da via fosfato pentose no metabolismo de glicose de lyse. O metabolismo da glicose de lysato alimentou a síntese de tiranosina-13C9, ao mesmo tempo em que forneceu um precursor para a produção de histidina-13C5.
É importante que as amostras de controle representem precisamente o tempo zero. Portanto, certifique-se de que as proteínas do lysate sejam inativadas antes da mistura na solução que contém fontes de energia. Também garanta que a integração automática de picos a partir de amostras de teste, amostras de controle e padrões também seja consistente, de modo que as áreas de pico extraídas sejam comparáveis.
