Ce protocole utilise la détection de l’indice de réfraction pour mesurer les sous-produits du métabolisme du carbone qui sont généralement accumulés dans les systèmes sans cellules à base de lysate. Il utilise également la spectrométrie de masse pour détecter un panel encore plus large de métabolites centraux générés dans les lysates métaboliquement actifs. Les deux techniques utilisées dans ce protocole permettent de décrire quantitativement les réactions chimiques qui se produisent dans un système sans cellules à base de lysate, ce qui permet de détecter un plus large éventail de métabolites, y compris ceux présents à de faibles concentrations dans le fond de lysate complexe.
Jaime Lorenzo Dinglasan et David Reeves, chercheurs diplômés de la Division des biosciences, feront la démonstration des procédures. Commencez par combiner les différents composants dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre pour préparer les réactions finales avec 4,5 milligrammes par millilitre de protéine de lysate totale. Préparez des réactions d’ingénierie métabolique sans cellule, ou CFME, avec des volumes finaux de 50 microlitres en trois fois par point de temps.
Terminez immédiatement les réactions triplicates à leurs moments appropriés en ajoutant un volume égal d’acide trichloroacétique à 5 % au volume de réaction final de chaque échantillon. Diluer ensuite chaque échantillon en ajoutant deux fois le volume d’eau stérile à chaque mélange réactionnel. Pour récapituler le temps zéro, mélanger le même volume d’acide trichloroacétique à 5 % que le volume total de réaction finale avec le lysate avant d’ajouter le reste des composants de la réaction.
Cette étape d’acidification précipite les enzymes lysate avant qu’elles ne métabolisent significativement le glucose. Vortex les échantillons et centrifuger sur une microcentrifugeuse de paillasse à 11 600 fois g pendant cinq minutes, et transférer les surnageants contenant les analytes organiques dans des tubes propres. Conservez les échantillons à moins 20 degrés Celsius si les analyses HPLC doivent être effectuées plus tard.
Assurez-vous de décongeler les échantillons entreposés sur de la glace avant de passer à l’étape suivante. Filtrez chaque surnageant avec un filtre à pores de 0,22 micromètre. Après la centrifugeuse, transférer chaque filtrat dans un flacon en verre HPLC propre.
Chargez les flacons sur le plateau d’échantillonnage automatique du système HPLC qui a déjà été configuré pour l’analyse. Dans la barre de menus, sélectionnez Séquence, Nouveau modèle de séquence. Sélectionnez Séquence.
Enregistrez le modèle de séquence en tant que nom de modèle de séquence S.Sélectionnez Séquence, Table de séquence. Ajoutez N lignes correspondant à N flacons. Entrez ensuite les positions des flacons et les noms des échantillons sous Le flacon et le Nom de l’échantillon, respectivement, en fonction de leur disposition sur le plateau d’échantillonnage automatique.
Sélectionnez la méthode générée comme décrit dans le manuscrit dans le menu déroulant Nom de la méthode et entrez 50 microlitres comme injection par flacon pour chaque ligne. Cliquez sur Appliquer, puis enregistrez le modèle de séquence en sélectionnant Séquence, Enregistrer le modèle de séquence. Assurez-vous que le modèle de séquence est chargé en sélectionnant Séquence, Modèle de séquence de charge, nom du modèle de séquence S.Après avoir obtenu une ligne de base stable sur le tracé en ligne, cliquez avec le bouton droit sur le panneau Module RID, Contrôle, Vanne de recyclage désactivée pour diriger le flux de solvant à travers le détecteur RID vers le déchet.
Pour démarrer l’acquisition de données, sélectionnez Séquence dans la barre de menus, puis Sélectionnez Table de séquence, Exécuter. Sélectionnez Vue Analyse des données dans le menu Affichage. Recherchez le nom du fichier de séquence dans la liste des fichiers sur le côté gauche de l’écran.
Sur le panneau central de l’écran, accédez à La sélection de la vue du signal, Signal RID pour afficher les exemples de chromatogrammes. Sélectionnez une ligne correspondant à l’un des échantillons dans le panneau supérieur de l’écran. Les pics correspondant aux analytes cibles seront disposés le long de l’axe du temps de rétention comme le glucose, le succinate, le lactate, le formaire, l’acétate et l’éthanol dans des échantillons où tous ces métabolites sont présents.
Discernez si les pics d’intérêt sont bien intégrés par le logiciel. Une ligne rouge doit être automatiquement tracée comme base de chaque pic. Si la ligne rouge est asymétrique, l’intégration automatique a échoué.
Sélectionnez ensuite le bouton Intégration manuelle dans l’ensemble d’outils d’intégration et dessinez manuellement une base de crête pour intégrer la zone de crête. Sélectionnez l’outil Curseur dans l’ensemble d’outils commun pour cliquer sur les pics correctement intégrés. La zone de crête et le temps de réaction correspondant au pic sélectionné seront mis en surbrillance sous la forme d’une ligne de tableau sur le panneau inférieur hors de l’écran.
Pour exporter les zones de pointe, sélectionnez Fichier, Exporter, Résultats de l’intégration. Tracer les valeurs de la surface de crête par rapport aux concentrations connues d’échantillons dans une feuille de calcul. Cliquez avec le bouton droit sur les données tracées, puis sélectionnez Ajouter une courbe de tendance, Mettre en forme la courbe de tendance, Afficher l’équation sur le graphique.
Dans une feuille de calcul distincte, utilisez les équations des courbes de tendance standard pour convertir les valeurs de la surface de crête en concentrations pour chaque analyte de chaque échantillon. Calculez les zones de crête moyennes et les valeurs d’erreur-type sur trois types pour la visualisation des données. Mettez en place des réactions triples par point temporel, à l’exception du temps zéro, sur la glace comme décrit dans le manuscrit.
Au lieu de glucose, utilisez une concentration finale de glucose-13C6 de 100 millimolaires dans les réactions. Incuber les réactions à 37 degrés Celsius pendant une, deux et trois heures. Pour commencer l’analyse, pipettez un volume équivalent du solvant d’extraction à chaque échantillon.
Si les échantillons ont été congelés, ajouter le solvant d’extraction avant que les échantillons ne décongelent complètement pour éviter la réactivation du métabolisme du glucose. Effectuez toutes les étapes de traitement des échantillons sur la glace. Pour récapituler le temps zéro, pipeter le volume final du solvant d’extraction à un volume approprié de lysate pour la concentration finale souhaitée de 4,5 milligrammes par millilitre dans 50 microlitres de volume de réaction.
Ajoutez le reste des composants de réaction comme décrit précédemment. Cette étape d’acidification précipite les enzymes lysate avant qu’elles ne métabolisent significativement le glucose. Incuber les échantillons dans un solvant d’extraction sur de la glace pendant 30 minutes en agitant doucement.
Ensuite, centrifugez les échantillons à 21 000 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius pour séparer le surnageant de la protéine précipitée. Transférez 50 microlitres du surnageant dans des flacons d’échantillonneur automatique et chargez les flacons sur le plateau dans l’échantillonneur automatique à quatre degrés Celsius. Après avoir préparé l’instrument pour l’analyse, configurez une séquence d’exécution à l’aide du logiciel d’acquisition et d’interprétation des données du système LC-MS/MS.
Dans Roadmap, Sequence Setup, cliquez avec le bouton droit sur le tableau pour insérer autant de lignes que d’exemples. Pour chaque rangée, réglez le volume d’injection sur cinq microlitres et la position sur la position respective du flacon sur le plateau d’échantillonnage automatique. Entrez les noms de fichiers en tant que noms d’exemple et définissez le chemin d’accès souhaité pour les résultats d’exécution.
Pour démarrer l’exécution, mettez en surbrillance tous les noms de fichiers de la séquence. Dans la barre de menus, sélectionnez Actions, Exécuter la séquence. Ouvrez MZmine et importez les fichiers de sortie bruts obtenus précédemment.
Dans la barre de menus, sélectionnez Méthodes de données brutes, Importation de données brutes, puis sélectionnez les fichiers correspondant aux exemples. Suivez les étapes décrites dans le manuscrit pour terminer l’analyse MZmine. Exportez les zones de crête brutes à la fin de l’analyse MZmine sous forme de fichier CSV.
Ouvrez une feuille de calcul pour calculer les masses de métabolites marqués au 13C du métabolisme du glucose pour la recherche ciblée. Utilisez les masses calculées des métabolites marqués au 13C pour rechercher et annoter les caractéristiques de masse à charge à partir des résultats de MZmine. Vérifiez manuellement les spectres des annotations putatives sur un navigateur de qualité pour confirmer les annotations.
Ouvrez Roadmap, Qual Browser. Dans la barre d’outils, ouvrez le fichier brut pour importer les données MS brutes de chaque échantillon. Tracez une ligne sous la plage de temps de rétention souhaitée correspondant à l’annotation putative sur le chromatogramme ionique total pour visualiser un spectre de masse.
Dans les expériences HPLC-RID, le glucose a été consommé dans les trois premières heures de la réaction et principalement fermenté en lactate. L’accumulation d’éthanol s’est également produite de manière significative dans les trois premières heures de la réaction et s’est arrêtée par la suite. L’acétate était initialement présent dans les réactions en tant que composant du tampon S30 et ne s’est accumulé en raison du métabolisme qu’après six heures, lorsque la consommation de glucose avait ralenti.
Le lactate et l’éthanol peuvent donc être considérés comme les principaux produits finaux de fermentation dans le métabolisme du glucose à base de lysate et sans cellules. Il a été observé que le formant et le succinate étaient synthétisés en tant que produits de fermentation mineurs. Le glucose-13C6 a été consommé de manière observable par glycolyse, comme en témoignent les fluctuations des intermédiaires glycolytiques.
Conformément aux données de détection de l’indice de réfraction HPLC, le glucose s’est accumulé en lactate-13C3 et a également été fermenté en succinate-13C3 dans les trois premières heures de la réaction. L’incorporation de carbones dérivés du glucose-13C6 dans les phosphates de sucre 6-phosphogluconolactone, 6-phosphogluconate, ribulose-5-phosphate et sédoheptulose-7-phosphate a également été observée, confirmant la participation de la voie du phosphate de pentose dans le métabolisme du glucose lysé. Le métabolisme du lysate de glucose s’est avéré alimenter la synthèse de la tyrosine-13C9, tout en fournissant un précurseur pour la production d’histidine-13C5.
Il est important que les échantillons de contrôle représentent précisément le temps zéro. Par conséquent, assurez-vous que les protéines du lysate sont inactivées avant de se mélanger dans la solution contenant des sources d’énergie. Assurez-vous également que l’intégration automatique des pics des échantillons d’essai, des échantillons de contrôle et des normes est également cohérente, afin que les zones de pic extraites soient comparables.
