Questo protocollo utilizza il rilevamento dell'indice di rifrazione per misurare i sottoprodotti del metabolismo del carbonio che sono comunemente accumulati in sistemi a base di lisato e privi di cellule. Fa anche uso della spettrometria di massa per rilevare un pannello ancora più ampio di metaboliti centrali che vengono generati nei lisati metabolicamente attivi. Le due tecniche utilizzate in questo protocollo forniscono la capacità di descrivere quantitativamente le reazioni chimiche che si verificano in un sistema a base di lsato, privo di cellule, consentendo di rilevare una gamma più ampia di metaboliti, compresi quelli presenti a basse concentrazioni nel complesso fondo del lisi.
A dimostrare le procedure saranno Jaime Lorenzo Dinglasan e David Reeves, ricercatori laureati della Divisione Bioscienze. Inizia combinando i diversi componenti in tubi microcentrifuga da 1,5 millilitro per preparare le reazioni finali con 4,5 milligrammi per millilitro di proteina di lizzata totale. Preparare reazioni di ingegneria metabolica senza cellule, o CFME, con volumi finali di 50 microlitri in triplice copia per punto temporale.
Terminare immediatamente le reazioni triplicate nei punti temporali appropriati aggiungendo un volume uguale di acido tricloroacetico al 5% del volume di reazione finale di ciascun campione. Quindi diluire ogni campione aggiungendo due volte il volume di acqua sterile a ciascuna miscela di reazione. Per ricapitolare il tempo zero, mescolare lo stesso volume di acido tricloroacetico al 5% del volume totale della reazione finale con il l'lisito prima di aggiungere il resto dei componenti della reazione.
Questa fase di acidificazione precipita gli enzimi del lsato prima che metabolizzano significativamente il glucosio. Vortice i campioni e centrifuga su una microcentrifuga da banco a 11.600 volte g per cinque minuti e trasferire i supernatanti contenenti gli analiti organici in tubi puliti. Conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius se le analisi HPLC devono essere condotte in un secondo momento.
Assicurarsi di scongelare i campioni conservati sul ghiaccio prima di procedere al passaggio successivo. Filtrare ogni surnatante con un filtro a pori da 0,22 micrometri. Dopo la centrifuga, trasferire ogni filtrato in un flaconcino di vetro HPLC pulito.
Caricare i flaconcini sul vassoio autocampionatore del sistema HPLC che è già stato impostato per l'analisi. Dalla barra dei menu, selezionate Sequenza, Nuovo modello di sequenza. Selezionate Sequenza (Sequence).
Salvare il modello di sequenza come nome del modello di sequenza S.Select Sequence, Sequence Table. Aggiungere N righe corrispondenti a N flaconcini. Quindi inserire le posizioni del flaconcino e i nomi dei campioni rispettivamente in Vial e Sample Name, in base alla loro disposizione sul vassoio dell'autocampionatore.
Selezionare il metodo generato come descritto nel manoscritto dal menu a discesa Nome metodo e inserire 50 microlitri come iniezione per flaconcino per ogni riga. Fare clic su Applica e salvare il modello di sequenza selezionando Sequenza, Salva modello sequenza. Assicurarsi che il modello di sequenza sia caricato selezionando Sequenza, Modello di sequenza di carico, nome del modello di sequenza S.Dopo aver raggiunto una linea di base stabile sul grafico online, fare clic con il pulsante destro del mouse sul pannello Modulo RID, Controllo, Valvola di riciclaggio Off per dirigere il flusso di solvente attraverso il rilevatore RID ai rifiuti.
Per avviare l'acquisizione dei dati, selezionare Sequenza dalla barra dei menu, quindi selezionare Tabella sequenza, Esegui. Selezionare la vista Analisi dati dal menu Visualizza. Individuate il nome del file di sequenza dall'elenco dei file sul lato sinistro dello schermo.
Nel pannello centrale sullo schermo, vai a Signal View Selection, RID Signal per visualizzare i cromatogrammi campione. Selezionare una riga corrispondente a uno qualsiasi dei campioni dal pannello superiore sullo schermo. I picchi corrispondenti agli analiti bersaglio saranno disposti lungo l'asse del tempo di ritenzione come glucosio, succinato, lattato, formate, acetato ed etanolo in campioni in cui sono presenti tutti questi metaboliti.
Discernere se i picchi di interesse sono ben integrati dal software. Una linea rossa dovrebbe essere disegnata automaticamente come base di ogni picco. Se la linea rossa è storta, l'integrazione automatica non è riuscita.
Quindi selezionare il pulsante Integrazione manuale dal set di strumenti di integrazione e disegnare manualmente una base di picco per integrare l'area di picco. Selezionate lo strumento Cursore dal set di strumenti comune per fare clic sui picchi correttamente integrati. L'area del picco e il tempo di reazione corrispondente del picco selezionato verranno evidenziati come una riga di tabella sul pannello inferiore fuori dallo schermo.
Per esportare le aree di picco, selezionare File, Esporta, Risultati integrazione. Tracciare i valori dell'area di picco rispetto alle concentrazioni note di campioni in un foglio di calcolo. Fare clic con il pulsante destro del mouse sui dati tracciati, quindi scegliere Aggiungi linea di tendenza, Formato linea di tendenza, Visualizza equazione sul grafico.
In un foglio di calcolo separato, utilizzare le equazioni delle linee di tendenza della curva standard per convertire i valori dell'area di picco in concentrazioni per ogni analita di ciascun campione. Calcola le aree di picco medie e i valori di errore standard su triplicati per la visualizzazione dei dati. Impostare reazioni triplicate per punto temporale, ad eccezione del tempo zero, sul ghiaccio come descritto nel manoscritto.
Invece di glucosio, utilizzare una concentrazione finale di glucosio-13C6 100 millimolare nelle reazioni. Incubare le reazioni a 37 gradi Celsius per una, due e tre ore. Per iniziare con l'analisi, pipettare un volume equivalente del solvente di estrazione a ciascun campione.
Se i campioni sono stati congelati, aggiungere il solvente di estrazione prima che i campioni si scongelino completamente per impedire la riattivazione del metabolismo del glucosio. Eseguire tutte le fasi di elaborazione del campione sul ghiaccio. Per ricapitolare il tempo zero, pipettare il volume finale del solvente di estrazione a un volume appropriato di lizzato per la concentrazione finale desiderata di 4,5 milligrammi per millilitro in 50 microlitri di volume di reazione.
Aggiungere il resto dei componenti di reazione come descritto in precedenza. Questa fase di acidificazione precipita gli enzimi del lsato prima che metabolizzano significativamente il glucosio. Incubare i campioni in solvente da estrazione su ghiaccio per 30 minuti con un delicato scuotimento.
Quindi centrifugare i campioni a 21.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius per separare il surnatante dalla proteina precipitata. Trasferire 50 microlitri del surnatante alle fiale dell'autocampionatore e caricare le fiale sul vassoio entro l'autocampionatore a quattro gradi Celsius. Dopo aver preparato lo strumento per l'analisi, impostare una sequenza di esecuzione utilizzando il software di acquisizione e interpretazione dei dati del sistema LC-MS/MS.
All'interno di Roadmap, Sequence Setup, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla tabella per inserire tante righe quanti esempi. Per ogni riga, impostare il volume di iniezione su cinque microlitri e la posizione sulla rispettiva posizione del flaconcino sul vassoio dell'autocampionatore. Immettere i nomi dei file come nomi di esempio e impostare il percorso di file desiderato per i risultati dell'esecuzione.
Per avviare l'esecuzione, evidenziare tutti i nomi di file nella sequenza. Dalla barra dei menu, selezionare Azioni, Esegui sequenza. Apri MZmine e importa i file di output grezzi ottenuti in precedenza.
Dalla barra dei menu, selezionare Metodi dati non elaborati, Importazione dati grezzi e selezionare i file corrispondenti agli esempi. Seguire i passaggi descritti nel manoscritto per completare l'analisi MZmine. Esporta le aree di picco grezze alla fine dell'analisi MZmine come file CSV.
Apri un foglio di calcolo per calcolare le masse dei metaboliti etichettati con 13C dal metabolismo del glucosio per la ricerca mirata. Utilizzare le masse calcolate dei metaboliti etichettati con 13C per cercare e annotare le caratteristiche di massa a carica dai risultati di MZmine. Controllare manualmente gli spettri delle annotazioni putative su un browser di qualità per confermare le annotazioni.
Apri Roadmap, Qual Browser. Dalla barra degli strumenti, apri il file raw per importare i dati MS grezzi di ciascun campione. Disegna una linea sotto l'intervallo desiderato di tempi di ritenzione corrispondenti all'annotazione putativa sul cromatogramma iono totale per visualizzare uno spettro di massa.
Negli esperimenti HPLC-RID, il glucosio è stato consumato entro le prime tre ore dalla reazione e principalmente fermentato in lattato. Anche l'accumulo di etanolo si è verificato in modo significativo entro le prime tre ore dalla reazione e si è fermato successivamente. L'acetato era inizialmente presente nelle reazioni come componente del tampone S30 e si accumulava solo a causa del metabolismo dopo sei ore, quando il consumo di glucosio era rallentato.
Il lattato e l'etanolo possono quindi essere considerati i principali prodotti finali di fermentazione nel metabolismo del glucosio a base di llitasi e senza cellule. È stato osservato che sia il formate che il succinato sono stati sintetizzati come prodotti di fermentazione minori. Il glucosio-13C6 è stato consumato in modo osservabile attraverso la glicolisi, come evidente dalle fluttuazioni degli intermedi glicolitici.
Coerentemente con i dati di rilevamento dell'indice di rifrazione HPLC, il glucosio si è accumulato in lattato-13C3 ed è stato anche fermentato a succinato-13C3 entro le prime tre ore dalla reazione. È stata inoltre osservata l'incorporazione di carboni derivati dal glucosio-13C6 ai fosfati di zucchero 6-fosfogluconolattone, 6-fosfogluconato, ribulosio-5-fosfato e sedoeptosio-7-fosfato, confermando la partecipazione della via del pentoso fosfato al metabolismo del glucosio del lsato. Il metabolismo del glucosio del lisato è stato trovato per alimentare la sintesi di tirosina-13C9, fornendo anche un precursore per la produzione di istidina-13C5.
È importante che i campioni di controllo rappresentino esattamente il tempo zero. Pertanto, assicurarsi che le proteine nel lisato siano inattivate prima della miscelazione nella soluzione contenente fonti energetiche. Garantire inoltre che anche l'integrazione automatica dei picchi da campioni di prova, campioni di controllo e standard sia coerente, in modo che le aree di picco estratte siano comparabili.
