פרוטוקול זה משתמש בזיהוי אינדקס שבירה כדי למדוד תוצרי לוואי של חילוף החומרים של פחמן שנצברו בדרך כלל במערכות מבוססות ליסאט, ללא תאים. זה גם עושה שימוש בספקטרומטריית מסה כדי לזהות פאנל רחב עוד יותר של מטבוליטים מרכזיים הנוצרים lysates פעיל מטבולית. שתי הטכניקות המשמשות בפרוטוקול זה מספקות את היכולת לתאר כמותית את התגובות הכימיות המתרחשות במערכת מבוססת ליסאט, ללא תאים, מה שמאפשר לזהות מגוון רחב יותר של מטבוליטים, כולל אלה הנמצאים בריכוזים נמוכים ברקע המורכב של ליסאט.
מי שידגימו את ההליכים יהיו חיימה לורנצו דינגלסאן ודיוויד ריבס, חוקרים בוגרים מהאגף לביו-מדעי החיים. התחל על ידי שילוב הרכיבים השונים בצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר כדי להכין תגובות סופיות עם 4.5 מיליגרם למיליליטר של חלבון ליסאט הכולל. הכן הנדסה מטבולית ללא תאים, או CFME, תגובות עם נפחים סופיים של 50 מיקרוליטרים במשולש לנקודת זמן.
לסיים את התגובות משולשות בנקודות הזמן המתאימות שלהם מיד על ידי הוספת נפח שווה של 5% חומצה trichloroacetic לנפח התגובה הסופי של כל מדגם. לאחר מכן לדלל כל מדגם על ידי הוספת פעמיים את נפח המים סטריליים לכל תערובת תגובה. כדי לשחזר את הזמן אפס, לערבב את אותו נפח של 5% חומצה trichloroacetic כמו נפח התגובה הסופי הכולל עם ליסאט לפני הוספת שאר רכיבי התגובה.
שלב החמצה זה מזרז אנזימי ליסאט לפני שהם מטבוליזם משמעותי של גלוקוז. מערבולת את הדגימות ואת הצנטריפוגה על microcentrifuge ספסל ב 11, 600 פעמים g במשך חמש דקות, ולהעביר את supernatants המכיל את הניתוחים האורגניים צינורות נקיים. אחסן את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס אם ניתוחי HPLC יבוצעו מאוחר יותר.
ודא להפשיר את הדגימות המאוחסנות על קרח לפני שתמשיך לשלב הבא. סנן כל סופר-נט עם מסנן נקבוביות של 0.22 מיקרומטר. לאחר צנטריפוגה, העבר כל סינון ל בקבוקון זכוכית HPLC נקי.
טען את הבקבוקונים על מגש הדגימה האוטומטית של מערכת HPLC שכבר הוגדרה לניתוח. מתוך שורת התפריטים, בחר רצף, תבנית רצף חדשה. בחר רצף.
שמור תבנית רצף כשם תבנית רצף S.Select Sequence, טבלת רצף. צרף שורות N המתאימות לבקבוקונים של N. לאחר מכן הזן מיקומי תחתונים ושמות לדוגמה תחת שם קסם ודוגמה, בהתאמה, בהתאם לסידור שלהם על מגש הדגימה האוטומטית.
בחר את השיטה שנוצרה כמתואר בכתב היד מהתפריט הנפתח שם שיטה, והזן 50 מיקרוליטרים כהזרקה לכל מטען עבור כל שורה. לחץ על החל ושמור את תבנית הרצף על-ידי בחירה באפשרות רצף, שמור תבנית רצף. ודא תבנית הרצף נטען על ידי בחירת רצף, תבנית רצף עומס, שם תבנית רצף S.After השגת בסיס יציב על התוויה המקוונת, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הלוח RID מודול, בקרה, שסתום מיחזור כבוי כדי לכוון את זרימת הממס דרך גלאי RID לפסולת.
כדי להתחיל ברכישת נתונים, בחר רצף מתוך שורת התפריטים ולאחר מכן בחר טבלת רצף, הפעל. בחר בתצוגת ניתוח נתונים מתפריט תצוגה. אתר את שם קובץ הרצף מרשימת הקבצים בצד שמאל של המסך.
בחלונית המרכזית על המסך, עבור אל בחירת תצוגת האות, RID Signal כדי להציג את הכרומטוגרמה לדוגמה. בחרו שורה המתאימה לכל אחת מהדוגמאות מהחלונית העליונה על המסך. פסגות המתאימות לנתחי היעד יהיו מסודרות לאורך ציר זמן השמירה כמו גלוקוז, תמציתי, לקטט, formate, אצטט, ואתנול בדגימות שבו כל מטבוליטים אלה נמצאים.
תבחין אם פסגות העניין משולבות היטב על ידי התוכנה. יש לצייר קו אדום באופן אוטומטי כבסיס של כל פסגה. אם הקו האדום הוא קשוח, השילוב האוטומטי נכשל.
לאחר מכן בחרו בלחצן 'אינטגרציה ידנית' מערכת כלי השילוב, ושרטטו ידנית בסיס שיא לשילוב אזור השיא. בחרו בכלי הסמן מתוך ערכת הכלים המשותפת כדי ללחוץ על פסגות משולבות כראוי. אזור השיא וזמן התגובה המתאים של הפסגה שנבחרה יודגשו כשורה בטבלה בחלונית התחתונה מחוץ למסך.
כדי לייצא אזורי שיא, בחר קובץ, ייצוא, תוצאות שילוב. התוויית ערכי אזור שיא לעומת ריכוזים ידועים של דוגמאות בגיליון אלקטרוני. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הנתונים המותווים ולאחר מכן בחר הוסף קו מגמה, עיצוב קו מגמה, הצג משוואה בתרשים.
בגיליון אלקטרוני נפרד, השתמש במשוואות של קווי מגמה סטנדרטיים של עקומה כדי להמיר ערכי אזור שיא לריכוזים עבור כל ניתוח מכל מדגם. חשב את אזורי השיא הממוצעים וערכי השגיאה הסטנדרטיים בין טריפליקאטים עבור פריט חזותי של נתונים. הגדר תגובות משולשות לנקודת זמן, למעט זמן אפס, על קרח כמתואר בכתב היד.
במקום גלוקוז, השתמש בריכוז הסופי של גלוקוז 100 מילימולר-13C6 בתגובות. לדגור על התגובות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה, שעתיים ושלוש שעות. כדי להתחיל עם הניתוח, pipette נפח שווה ערך של ממס החילוץ לכל מדגם.
אם הדגימות הוקפאו, להוסיף את ממס החילוץ לפני הדגימות להפשיר לחלוטין כדי למנוע את ההפעלה מחדש של חילוף החומרים גלוקוז. בצע את כל שלבי העיבוד לדוגמה על קרח. כדי לשחזר את הזמן אפס, pipette את הנפח הסופי של ממס החילוץ לנפח מתאים של ליסאט לריכוז הסופי הרצוי של 4.5 מיליגרם למיליליטר ב 50 microliters של נפח התגובה.
הוסף את שאר רכיבי התגובה כמתואר קודם לכן. שלב החמצה זה מזרז אנזימי ליסאט לפני שהם מטבוליזם משמעותי של גלוקוז. לדגור על הדגימות בממס מיצוי על קרח במשך 30 דקות עם רועד עדין.
ואז צנטריפוגה הדגימות ב 21, 000 פעמים גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להפריד את supernatant מן החלבון המזרז. העבר 50 מיקרוליטרים של supernatant לבקבוקונים autosampler, ולהעמיס את הבקבוקונים על המגש בתוך ארבע מעלות צלזיוס autosampler. לאחר הכנת המכשיר לניתוח, הגדר רצף ריצה באמצעות תוכנת רכישת הנתונים והפרשנות של מערכת LC-MS/MS.
בתוך מפת דרכים, הגדרת רצף, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הטבלה כדי להוסיף שורות רבות ככל דוגמאות. עבור כל שורה, הגדר את נפח ההזרקה לחמישה מיקרוליטרים ואת המיקום למיקום המתאים של הוויאל על מגש הדגימה האוטומטית. הזן שמות קבצים כשמות לדוגמה והגדר את נתיב הקובץ הרצוי לקבלת תוצאות ריצה.
כדי להתחיל את ההפעלה, סמן את כל שמות הקבצים ברצף. מתוך שורת התפריטים, בחר פעולות, הפעל רצף. פתח את MZmine וייבוא קבצי הפלט הגולמיים שהושגו בעבר.
מתוך שורת התפריטים, בחר שיטות נתונים גולמיות, ייבוא נתונים גולמיים ובחר את הקבצים המתאימים לדגימות. בצע את השלבים המתוארים בכתב היד כדי להשלים את ניתוח MZmine. יצא את אזורי השיא הגולמיים בסוף ניתוח MZmine כקובץ CSV.
פתח גיליון אלקטרוני כדי לחשב את המסות של מטבוליטים 13C-תווית מטבוליזם גלוקוז עבור החיפוש הממוקד. השתמש במסות מחושבות של מטבוליטים בעלי תווית 13C כדי לחפש ולהביא ביאור לתכונות של טעינה המונית מתוצאות MZmine. בדוק באופן ידני את הספקטרום של הביאורים putative בדפדפן איכות כדי לאשר את הביאורים.
מפת דרכים פתוחה, דפדפן קוואלי. מסרגל הכלים, פתח קובץ גולמי כדי לייבא נתוני MS גולמיים של כל דגימה. צייר קו תחת הטווח הרצוי של זמני השמירה המתאימים לביאור putative על כרומטוגרמה יון הכוללת כדי להציג ספקטרום מסה.
בניסויי HPLC-RID, גלוקוז נצרך בשלוש השעות הראשונות של התגובה ובעיקר הותסס לקטט. הצטברות אתנול התרחשה גם באופן משמעותי בשלוש השעות הראשונות של התגובה ונעצרה לאחר מכן. אצטט היה נוכח בתחילה בתגובות כמרכיב של חיץ S30 והצטבר רק עקב חילוף החומרים לאחר שש שעות, כאשר צריכת הגלוקוז האטה.
לפיכך, לקטט ואתנול יכולים להיחשב כמוצרי הקצה העיקריים של תסיסה בחילוף חומרים של גלוקוז מבוסס ליסאט, ללא תאים. זה נצפתה כי הן formate והן תמציתי היו מסונתזים כמו מוצרי תסיסה קלים. גלוקוז-13C6 נצרך באופן נצפה באמצעות גליקוליזה, כפי שניתן לראות על ידי התנודות ביניים גליקוליטי.
בהתאם לנתוני זיהוי האנזים השבירה של HPLC, גלוקוז הצטבר לקטט-13C3 וגם הותסס לתמצית-13C3 בשלוש השעות הראשונות של התגובה. שילוב של גלוקוז-13C6 נגזר פחמנים סוכר פוספטים 6-פוספוגלוקונקונקולקטון, 6-פוספוגלוקונאט, ריבולוז-5-פוספט, ו sedoheptulose-7-פוספט נצפתה גם, המאשר את ההשתתפות של מסלול פנטוז פוספט בחילוף החומרים של גלוקוז ליסאט. חילוף החומרים של גלוקוז ליסאט נמצא להאכיל טירוצין-13C9 סינתזה, תוך מתן הקדמה לייצור היסטידין-13C5.
חשוב שדגימות הבקרה ייצגו במדויק את זמן אפס. לכן, ודא כי החלבונים בליסאט אינם מומתים לפני ערבוב בתמיסה המכילה מקורות אנרגיה. כמו כן, ודא כי שילוב אוטומטי של פסגות מדגימות בדיקה, דגימות בקרה, ותקנים הוא עקבי גם כן, כך אזורי שיא שחולצו הם דומים.
