Bu protokol, lysate tabanlı, hücresiz sistemlerde yaygın olarak biriken karbon metabolizmasının yan ürünlerini ölçmek için kırılma indisi algılamasını kullanır. Ayrıca metabolik olarak aktif lisatlarda üretilen daha geniş bir merkezi metabolit panelini tespit etmek için kütle spektrometresini kullanır. Bu protokolde kullanılan iki teknik, lisat tabanlı, hücresiz bir sistemde meydana gelen kimyasal reaksiyonları nicel olarak tanımlama yeteneği sağlar ve karmaşık lisat arka planında düşük konsantrasyonlarda bulunanlar da dahil olmak üzere daha geniş bir metabolit yelpazesini tespit etmeyi mümkün kılır.
Prosedürleri gösteren jaime Lorenzo Dinglasan ve David Reeves, Biosciences Bölümü'nden yüksek lisans araştırmacıları olacak. Toplam lysat proteininin mililitresi başına 4,5 miligram ile nihai reaksiyonları hazırlamak için farklı bileşenleri 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde birleştirerek başlayın. Zaman noktası başına üç taraflı olarak 50 mikrolitrelik son hacimli hücresiz metabolik mühendislik veya CFME reaksiyonları hazırlayın.
Her numunenin son reaksiyon hacmine eşit hacimde %5 trikloroasetik asit ekleyerek triplikat reaksiyonları uygun zaman noktalarında derhal sonlandırın. Daha sonra her reaksiyon karışımına iki kat daha fazla steril su ekleyerek her numuneyi seyreltin. Sıfır süresini yeniden yakalamak için, reaksiyon bileşenlerinin geri kalanını eklemeden önce toplam son reaksiyon hacmiyle aynı hacimde %5 trikloroasetik asiti lisatla karıştırın.
Bu asitleşme adımı, glikozu önemli ölçüde metabolize etmeden önce lysate enzimlerini çökeltir. Örnekleri ve santrifüjleri 11,600 kez g'da bir tezgah üstü mikrosantrifüj üzerinde beş dakika boyunca girdaplayın ve organik analizleri içeren süpernatantları temiz tüplere aktarın. HPLC analizleri daha sonra yapılacaksa numuneleri eksi 20 santigrat derecede saklayın.
Bir sonraki adıma geçmeden önce depolanan numuneleri buz üzerinde çözdüğünüzden emin olun. Her bir süpernatant'ı 0,22 mikrometre gözenek filtresiyle filtreleyin. Santrifüjden sonra, her bir filtratı temiz bir HPLC cam şişesine aktarın.
Şişeleri, analiz için önceden ayarlanmış olan HPLC sisteminin otomatik örnekleyici tepsisine yükleyin. Menü çubuğundan Sıra, Yeni Sıra Şablonu'nü seçin. Sıra'yı seçin.
Sıra şablon şablon adını S.Sıra seç, Sıra tablosu olarak sıra şablon kaydedin. N şişelerine karşılık gelen N satırlarını ekle. Daha sonra otomatik örnekleme tepsislerindeki düzenlemelerine göre sırasıyla Şişe ve Örnek Adı altına şişe konumlarını ve örnek adları girin.
Yöntem Adı açılır menüsünden yazıda açıklandığı gibi oluşturulan yöntemi seçin ve her satır için şişe başına enjeksiyon olarak 50 mikrolitre girin. Uygula'yı tıklatın ve Sıra, Sıra Şablonlarını Kaydet'i seçerek sıra şablonını kaydedin. Sıralı şablonun Sıra, Yükleme Sırası Şablonu, sıra şablonu adı S.Online çizimde kararlı bir taban çizgisi elde ettikten sonra, SOLVENT akışını RID dedektöründen atıklara yönlendirmek için panel RID Modülü, Kontrol, Kapalı Geri Dönüşüm Vanası'nı sağ tıklatın.
Veri alımını başlatmak için menü çubuğundan Sırala'yı seçin ve sonra Sıra tablosu, Çalıştır'ı seçin. Görünüm menüsünden Veri Analizi görünümünü seçin. Sıralı dosya adını ekranın sol tarafındaki dosya listesinden bulun.
Ekrandaki orta panelde, örnek kromatogramları görüntülemek için Sinyal Görünümü Seçimi, RID Sinyali'ne gidin. Ekrandaki üst panelden örneklerden herhangi birine karşılık gelen bir satır seçin. Hedef analitlere karşılık gelen tepeler, tüm bu metabolitlerin bulunduğu örneklerde glikoz, süksinit, laktat, format, asetat ve etanol olarak tutma süresi ekseni boyunca düzenlenecektir.
İlginin zirvelerinin yazılım tarafından iyi entegre edilip edilmediğini ayırt edin. Her tepenin tabanı olarak otomatik olarak kırmızı bir çizgi çizilmelidir. Kırmızı çizgi askew ise, otomatik tümleştirme başarısız olmuştur.
Ardından, Tümleştirme Araç Kümesi'nden El ile Tümleştirme düğmesini seçin ve tepe alanını tümleştirmek için el ile bir tepe tabanı çizin. Düzgün tümleşik tepelere tıklamak için Ortak Araç Kümesi'nden İmleç aracını seçin. Tepe alanı ve seçilen tepenin karşılık gelen reaksiyon süresi, ekranın altındaki alt panelde bir tablo satırı olarak vurgulanır.
Tepe alanlarını dışa vermek için Dosya, Dışarı Aktar, Tümleştirme Sonuçları'nı seçin. Bir elektronik tablodaki bilinen numune konsantrasyonlarına karşı tepe alanı değerlerini çizin. Çizilen verileri sağ tıklatın ve Eğilim Çizgisi Ekle, Eğilim Çizgisini Biçimlendir, Denklemi Grafikte Görüntüle'yi seçin.
Ayrı bir elektronik tabloda, tepe alanı değerlerini her örnekteki her analiz için konsantrasyonlara dönüştürmek için standart eğri eğilim çizgilerinin denklemlerini kullanın. Veri görselleştirmesi için üç taraflı ortalama tepe alanlarını ve standart hata değerlerini hesaplayın. El yazmasında açıklandığı gibi buz üzerinde sıfır zamanı hariç, zaman noktası başına üç taraflı reaksiyonlar ayarlayın.
Glikoz yerine, reaksiyonlarda 100 milimoler glikoz-13C6 son konsantrasyonu kullanın. Reaksiyonları 37 santigrat derecede bir, iki ve üç saat kuluçkaya yatır. Analizle başlamak için pipet, her numuneye ekstraksiyon çözücüsunun eşdeğer bir hacmini pipetler.
Numuneler dondurulduysa, glikoz metabolizmasının yeniden etkinleştirildiğini önlemek için numuneler tamamen çözülmeden önce ekstraksiyon çözücüsüyü ekleyin. Tüm numune işleme adımlarını buz üzerinde gerçekleştirin. Sıfır süresini yeniden yakalamak için, 50 mikrolitre reaksiyon hacminde mililitre başına 4,5 miligram istenen son konsantrasyon için son ekstraksiyon çözücü hacmini uygun bir lysate hacmine pipet.
Reaksiyon bileşenlerinin geri kalanını daha önce açıklandığı gibi ekleyin. Bu asitleşme adımı, glikozu önemli ölçüde metabolize etmeden önce lysate enzimlerini çökeltir. Numuneleri buz üzerinde ekstraksiyon çözücüslerinde hafifçe sallanarak 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra örnekleri 21.000 kez g'da 15 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjle santrifüj ederek süpernatantı çökük proteinden ayırın. Süpernatantın 50 mikrolitresini otomatik örnekleyici şişelere aktarın ve şişeleri dört santigrat derece otomatik örnekleyici içinde tepsiye yükleyin. Cihazı analize hazırladıktan sonra, LC-MS/MS sisteminin veri toplama ve yorumlama yazılımını kullanarak bir çalışma dizisi ayarlayın.
Yol Haritası, Sıralı Kurulum'da, örnek kadar satır eklemek için tabloyu sağ tıklatın. Her satır için enjeksiyon hacmini beş mikrolitreye ve şişenin otomatik örnekleme tepsisinde ilgili konumuna ayarlayın. Dosya adlarını örnek adlar olarak girin ve çalıştırma sonuçları için istediğiniz dosya yolunu ayarlayın.
Çalıştırmayı başlatmak için, sıradaki tüm dosya adlarını vurgulayın. Menü çubuğunda Eylemler, Sırayı Çalıştır'ı seçin. MZmine'yi açın ve daha önce elde edilen ham çıktı dosyalarını alın.
Menü çubuğundan Ham Veri Yöntemleri, Ham Veri alma'yı seçin ve örneklere karşılık gelen dosyaları seçin. MZmine analizini tamamlamak için makalenin içinde açıklanan adımları izleyin. MZmine analizinin sonundaki ham tepe alanlarını CSV dosyası olarak dışa aktarın.
Hedeflenen arama için glikoz metabolizmasından 13C etiketli metabolit kütlelerini hesaplamak için bir elektronik tablo açın. MZmine sonuçlarından kütleden şarja özellikleri aramak ve açıklama eklemek için 13C etiketli metabolitlerden oluşan hesaplanan kütleleri kullanın. Ek açıklamaları onaylamak için kaliteli bir tarayıcıda putatif ek açıklamaların spektrumunu el ile kontrol edin.
Yol Haritası, Qual Browser'ı açın. Araç çubuğundan, her örneğin ham MS verilerini almak için ham dosyayı açın. Kütle spektrumunu görüntülemek için toplam iyon kromatogramındaki putatif ek açıklamaya karşılık gelen istenen saklama süresi aralığının altına bir çizgi çizin.
HPLC-RID deneylerinde, glikoz reaksiyondan sonraki ilk üç saat içinde tüketildi ve esas olarak laktat için fermente edildi. Etanol birikimi de reaksiyonun ilk üç saati içinde önemli ölçüde meydana geldi ve daha sonra durdu. Asetat başlangıçta S30 tamponunun bir bileşeni olarak reaksiyonlarda mevcuttu ve sadece glikoz tüketiminin yavaşladığında altı saat sonra metabolizma nedeniyle birikti.
Laktat ve etanol böylece lysate bazlı, hücresiz glikoz metabolizmasında başlıca fermantasyon son ürünleri olarak düşünülebilir. Hem format hem de süksinitinin küçük fermantasyon ürünleri olarak sentezlendiği gözlendi. Glikoz-13C6, glikolitik ara ürünlerdeki dalgalanmalarda belirgin olduğu gibi glikoliz yoluyla gözle görülür şekilde tüketildi.
HPLC kırma indeks algılama verileri ile tutarlı olarak, glikoz laktat-13C3'e birikti ve reaksiyondan sonraki ilk üç saat içinde succinate-13C3 için fermente edildi. Glikoz-13C6 türevi karbonların şeker fosfatları 6-fosfooğluconolactone, 6-fosfosatkonat, ribüloz-5-fosfat ve sedoheptüloz-7-fosfata dahil olduğu da gözlendi ve pentoz fosfat yolunun glisate glikoz metabolizmasına katılımını doğruladı. Lizat glikoz metabolizmasının tirozin-13C9 sentezini beslediği ve aynı zamanda histidin-13C5 üretimi için bir öncü sağladığı bulunmuştur.
Denetim örneklerinin sıfır zamanını tam olarak temsil ettiği önemlidir. Bu nedenle, enerji kaynaklarını içeren çözeltide karıştırmadan önce lysate'deki proteinlerin inaktive olduğundan emin olun. Ayrıca, çıkarılan tepe alanlarının karşılaştırılabilir olması için test örneklerinden, kontrol örneklerinden ve standartlardan tepelerin otomatik entegrasyonunun da tutarlı olduğundan emin olun.
