이 프로토콜은 굴절률 검출을 사용하여 용액 기반의 세포 없는 시스템에서 일반적으로 축적되는 탄소 대사의 부산물을 측정합니다. 그것은 또한 대사 활성 lysates에서 생성 되는 중앙 대사 산물의 더 넓은 패널을 감지 하기 위해 질량 분광법을 사용 하 여. 이 프로토콜에 사용되는 두 가지 기술은 lysate 기반의 세포 없는 시스템에서 발생하는 화학 반응을 정량적으로 설명할 수 있는 기능을 제공하므로 복잡한 lysate 배경에서 낮은 농도에 존재하는 대사 산물을 포함하여 더 넓은 범위의 대사산물을 검출할 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 생명 과학 과에서 대학원 연구원 인 제이미 로렌조 딩글라산과 데이비드 리브스입니다. 1.5 밀리리터 미세 센심 분리기 튜브에 다른 성분을 결합하여 총 lysate 단백질의 밀리리터 당 4.5 밀리그램으로 최종 반응을 준비하십시오. 시간 당 삼중판에 50 마이크로 리터의 최종 볼륨으로 세포없는 신진 대사 공학, 또는 CFME, 반응을 준비합니다.
각 시료의 최종 반응 부피에 5%트리클로로아세트산의 동일한 부피를 추가하여 적절한 시간 지점에서 즉시 삼중 반응을 종료합니다. 그런 다음 각 반응 혼합물에 멸균수의 2배를 첨가하여 각 샘플을 희석시 희석시다. 시간 0을 다시 수주하려면, 반응 성분의 나머지 부분을 추가하기 전에 용액과 총 최종 반응 부피와 5%트리클로로아세트산의 동일한 부피를 혼합한다.
이 산성화 단계는 포도당을 현저하게 대사하기 전에 효소를 침전시합니다. 5분 동안 11, 600배 g의 벤치탑 미세원심분리기의 시료와 원심분리기를 소용돌이시키고, 유기 적폐물을 함유한 수퍼나티를 깨끗한 튜브로 옮긴다. HPLC 분석을 나중에 수행하려면 샘플을 섭씨 영하 20도에 저장합니다.
다음 단계로 진행하기 전에 얼음에 저장된 샘플을 해동하십시오. 0.22 마이크로미터 모공 필터로 각 상체를 필터링합니다. 원심분리기 후 각 여과물을 깨끗한 HPLC 유리 유리 바이알로 옮기습니다.
분석을 위해 이미 설정된 HPLC 시스템의 자동 샘플러 트레이에 바이알을 로드합니다. 메뉴 표시줄에서 시퀀스, 새 시퀀스 템플릿을 선택합니다. 시퀀스를 선택합니다.
시퀀스 템플릿을 시퀀스 템플릿 이름 S.Select Sequence, 시퀀스 테이블로 저장합니다. N 바이알에 해당하는 N 행을 부속시다. 그런 다음 자동 샘플러 트레이의 배열에 따라 바이알 및 샘플 이름 아래에 각각 바이알 위치 및 샘플 이름을 입력합니다.
메서드 이름 드롭다운 메뉴에서 원고에 설명된 대로 생성된 메서드를 선택하고 각 행에 대해 바이알당 주입으로 50 마이크로리터를 입력합니다. 시퀀스를 선택하여 적용을 클릭하고 시퀀스 템플릿을 저장합니다. 시퀀스 템플릿을 선택하 여 로드 되어 있는지 확인, 로드 시퀀스 템플릿, 시퀀스 템플릿 이름 S.온라인 플롯에 안정적인 기준을 달성 한 후, 패널 RID 모듈을 마우스 오른쪽 버튼 클릭, 제어, 오프 재활용 밸브 낭비에 RID 검출기를 통해 용매 흐름을 지시.
데이터 수집을 시작하려면 메뉴 모음에서 시퀀스를 선택한 다음 시퀀스 테이블을 선택합니다. 보기 메뉴에서 데이터 분석 보기를 선택합니다. 화면 왼쪽에 있는 파일 목록에서 시퀀스 파일 이름을 찾습니다.
화면의 중앙 패널에서 시그널 뷰 선택, RID 신호로 이동하여 샘플 크로마토그램을 봅니다. 화면의 상단 패널에서 샘플에 해당하는 행을 선택합니다. 표적 성역에 대응하는 피크는 포도당, 간결한, 젖산, 포르메이트, 아세테이트 및 에탄올로서 보존 시간 축을 따라 배치됩니다.
관심의 피크가 소프트웨어에 의해 잘 통합되어 있는지 여부를 분별하십시오. 빨간색 선은 각 피크의 기준으로 자동으로 그려져야 합니다. 빨간색 선이 스큐인 경우 자동 통합이 실패했습니다.
그런 다음 통합 도구 세트에서 수동 통합 단추를 선택하고 피크 베이스를 수동으로 그려 피크 영역을 통합합니다. 제대로 통합된 피크를 클릭하여 공통 도구 집합에서 커서 도구를 선택합니다. 선택한 피크의 피크 영역과 해당 반응 시간은 화면 의 하단 패널의 테이블 행으로 강조 표시됩니다.
피크 영역을 내보내려면 파일, 내보내기, 통합 결과를 선택합니다. 스프레드시트에서 샘플농도에 비해 피크 영역 값을 플롯합니다. 플롯된 데이터를 마우스 오른쪽 단추로 클릭한 다음 추세선 추가, 형식 추세선, 차트에 방정식 표시를 선택합니다.
별도의 스프레드시트에서 표준 곡선 추세선의 방정식을 사용하여 각 샘플의 모든 별분별에 대해 피크 영역 값을 농도로 변환합니다. 데이터 시각화를 위한 트리클리세이트 에서 평균 피크 영역과 표준 오류 값을 계산합니다. 원고에 설명된 대로 얼음에 시간 제로를 제외한 시간당 삼중 반응을 설정합니다.
포도당 대신, 반응에 100 밀리머 포도당-13C6의 최종 농도를 사용. 1, 2, 3시간 동안 섭씨 37도에서 반응을 배양합니다. 분석부터 시작하여 각 샘플에 추출 용매의 동등한 부피를 피펫합니다.
시료가 동결된 경우, 포도당 대사의 재활성화를 방지하기 위해 샘플이 완전히 해동하기 전에 추출 용매를 추가합니다. 얼음의 모든 샘플 처리 단계를 수행합니다. 시간 0을 재구성하기 위해, 50 마이크로리터의 반응 부피에서 밀리리터당 4.5 밀리그램의 원하는 최종 농도를 위해 추출 용매의 최종 부피를 적절한 양의 용액으로 피펫합니다.
앞에서 설명한 반응 구성 요소의 나머지 부분을 추가합니다. 이 산성화 단계는 포도당을 현저하게 대사하기 전에 효소를 침전시합니다. 부드러운 흔들림으로 30분 동안 얼음에 추출 용매로 샘플을 배양합니다.
그런 다음 샘플을 섭씨 4도에서 15분 동안 21, 000배 g에서 원심분리하여 침전된 단백질과 상수체를 분리합니다. 슈퍼리소르의 50마이크로리터를 자동 샘플러 바이알로 옮기고 바이알을 섭씨 4도 내의 트레이에 적재합니다. 분석을 위해 계측기를 준비한 후 LC-MS/MS 시스템의 데이터 수집 및 해석 소프트웨어를 사용하여 실행 시퀀스를 설정합니다.
로드맵 내에서 시퀀스 설정, 테이블을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 샘플만큼 많은 행을 삽입합니다. 각 행에 대해 사출 볼륨을 5마이크로리터로 설정하고 오토샘플러 트레이에서 바이알의 각 위치로 위치를 설정합니다. 파일 이름을 샘플 이름으로 입력하고 실행 결과에 대해 원하는 파일 경로를 설정합니다.
실행을 시작하려면 시퀀스의 모든 파일 이름을 강조 표시합니다. 메뉴 표시줄에서 작업, 실행 시퀀스를 선택합니다. MZmine을 열고 이전에 얻은 원시 출력 파일을 가져옵니다.
메뉴 표시줄에서 원시 데이터 메서드, 원시 데이터 가져오기를 선택하고 샘플에 해당하는 파일을 선택합니다. MZmine 분석을 완료하기 위해 원고에 설명된 단계를 따릅니다. MZmine 분석 끝에 있는 원시 피크 영역을 CSV 파일로 내보냅니다.
스프레드시트를 열어 표적 검색을 위해 포도당 대사로부터 13C 표지대사산물의 질량을 계산합니다. 13C 라벨 대사 산물의 계산 된 질량을 사용하여 MZmine 결과에서 대량 충전 기능을 검색하고 송신하십시오. 품질 브라우저에서 푸티에 주석의 스펙트럼을 수동으로 확인하여 주석을 확인합니다.
로드맵 오픈, 퀄리티 브라우저. 도구 표시줄에서 원시 파일을 열어 각 샘플의 원시 MS 데이터를 가져옵니다. 질량 스펙트럼을 보기 위해 총 이온 크로마토그램에 푸티트 음장에 해당하는 원하는 보존 시간 아래에 선을 그립니다.
HPLC-RID 실험에서, 포도당은 반응의 처음 3 시간 이내에 소비되었고 주로 젖산으로 발효되었다. 에탄올 축적또한 반응의 첫 3시간 이내에 현저히 발생하였고 그 이후에 중단하였다. 아세테이트는 처음에 S30 완충제의 성분으로서 반응에 존재했으며, 포도당 소비가 느려졌을 때 6시간 후에만 신진대사로 인해 축적되었다.
따라서 젖산 및 에탄올은 lysate 기반의 세포 없는 포도당 대사의 주요 발효 최종 제품으로 간주될 수 있습니다. 그것은 소두근과 간결 모두 사소한 발효 제품으로 합성 된 것으로 관찰되었다. 포도당-13C6은 글리코리스틱 중급제의 변동에 의해 명백히 드러나는 글리코리시스를 통해 관찰 가능하게 소비되었다.
HPLC 굴절률 검출 데이터와 일치하여, 포도당은 젖산-13C3에 축적되고 또한 반응의 첫번째 3 시간 안에-13C3를 간결하게 하기 위하여 발효되었다. 포도당-13C6 유래 탄본을 당인산염 6-인산글루코놀락톤, 6-인포글루코놀락톤, 6-인플루오코네이트, 리불로오스-5-인산염 및 세도헤플루로오스-7-인산염에 통합하여 포도당 대사에 펜토세 인산염의 참여를 확인하는 것이 관찰되었다. 용액 포도당 물질 대사 티로신-13C9 합성을 공급 하는 것으로 나타났습니다., 또한 히스티딘-13C5 생산을 위한 선구자를 제공 하는 동안.
컨트롤 샘플은 시간 제로를 정확하게 나타내는 것이 중요합니다. 따라서, 용액을 함유하는 용액에서 혼합하기 전에 용액의 단백질이 비활성화되어 있는지 확인한다. 또한 테스트 샘플, 제어 샘플 및 표준에서 피크를 자동으로 통합하여 추출된 피크 영역과 비교할 수 있도록 일관성을 유지합니다.
