يقدم هذا البروتوكول طريقة للصورة الحية ، وتجميع الدوائر الشمية على مستوى محور واحد من دماغ نام. تشريح لتنظيف الأنسجة التي تغطي الدماغ النامي ، يمكننا جمع صور عالية الجودة من الدماغ الداخلي. توفر هذه الطريقة رؤى قيمة حول الأساس البيولوجي للخلية لتطوير الدائرة.
يمكن تعديله بسهولة لدراسة تطور الدوائر الأخرى أيضا. يستغرق الأمر بعض الوقت حتى يتمكن الشخص من إجراء تحكم مستقر في اليد في التشريح المجهري. المزيد من الممارسة ستكون مفيدة.
للبدء ، قم بإعداد طبق الثقافة لتعبئة الإكسبانتاج أثناء التصوير بفاصل زمني عن طريق وضع سيلغارد بسماكة 0.5 سم على السطح السفلي لطبق بتري وتركه يشفى لمدة 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة. لإعداد دبابيس صغيرة لشل حركة الإكسباج على هذه اللوحة باستخدام ملقط ، قم بلصق العديد من المسامير الدقيقة على شريط مع محاذاة النهايات الحادة على جانب واحد وقطع مليمترين من النهايات الحادة بالمقص. ثم باستخدام الملقط ، أدخل المسامير الدقيقة المقطوعة في طبقة سيلغارد من لوحة سيلغارد مسبقة الصنع.
باستخدام فرشاة ، قم بجمع الشرانق البيضاء ، التي تشكل puparium في غضون ساعة واحدة ونقلها إلى قارورة جديدة. احتضن الشرانق في الحمام المائي المخفف عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة لحث استنساخ ORN المتناثر من الأنواع العشوائية. بعد الصدمة الحرارية ، ضع القارورة عند 25 درجة مئوية لمدة 30 ساعة مما أدى إلى ظهور شرانق عمرها 30 ساعة بعد تكوين البوباريوم.
ثم قم بإعداد وسيط الثقافة للزراعة كما هو موضح في مخطوطة النص وتخزينها عند أربع درجات مئوية. في يوم التصوير ، أضف مصل البقر الجنيني ، ومحلول مخزون الأنسولين البشري ، ومحلول مخزون الهيدروكسي إيكديسون 20 يذوب في الإيثانول إلى قارورة 50 ملليلتر تحتوي على 45 ملليلتر من وسط ذبابة الفاكهة من شنايدر. اخلطي جيدا وانقلي 15 ملليلتر من الوسط الكامل إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر وخزني بقية الوسط الكامل عند أربع درجات مئوية لمدة أسبوع.
ثم قم بتغطية فتحة الأنابيب التي تحتوي على وسط كامل مع فيلم البارافين وأكسجين الوسط عن طريق ضخ فقاعات الأكسجين تحت سطح السائل من خلال طرف ماصة معقم سعة خمسة ملليلتر بمعدل فقاعة واحدة في الثانية لمدة 20 إلى 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتعقيم سطح بئر التشريح ولوحة سيلغارد المعدة مسبقا بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركها تجف قبل الاستخدام. استخدم فرشاة لنقل خادرة APF لمدة 30 ساعة إلى ورقة مناديل لتجفيف السطح الخارجي للخادرة لمدة خمس دقائق.
بعد تطبيق شريط على الوجهين على شريحة زجاجية ، قم بتوصيل الخادرة المجففة بعناية بالسطح اللزج للشريط مع الجانب الظهري المواجه لأعلى. اضغط بلطف على الخادرة بفرشاة لتوصيل الجانب البطني بشكل صحيح بالشريط دون إتلاف الخادرة. أدخل طرف حاد واحد من الملقط بين علبة العذراء البنية والخادرة من الجانب الجانبي وكسر حالة العذراء البنية بعناية من خلال خط إلى الطرف الخلفي من الخادرة.
بمجرد فتح علبة العذراء البنية ، باستخدام الملقط ، أمسك الخادرة بلطف وانقلها إلى بئر التشريح الذي يحتوي على ملليلتر واحد من الوسط الكامل المؤكسج. غمر الخادرة في الوسط لإغراقها في قاع البئر. لتشريح دماغ الهوائي من الخادرة ، أمسك الخادرة بلطف باستخدام ملقط بيد واحدة وباستخدام زوج من المقصات الدقيقة ، قم بإنشاء ثقب صغير من الجانب الخلفي من الخادرة ، والذي يطلق ضغطا عاليا داخل الخادرة.
بدءا من الحفرة ، قم بقطع خط الوسط البطني حتى الرقبة ، ثم قطع محيط الرقبة لفصل الرأس عن جسم الخادرة ووضع الجسم في بئر مختلف. بعد ذلك ، قم بقطع البشرة الشفافة التي تغطي الجانب الظهري من الدماغ لفضح الجسم الدهني أعلى الدماغ ، مما يضمن الحفاظ على البشرة التي ترتبط بها شبكية العين والهوائي وبالمثل ، قطع البشرة من الجانب البطني للدماغ. ماصة الوسط نحو المناطق المفتوحة على الجانبين الظهري والبطني للرأس باستخدام ماصة P10 لغسل الجسم الدهني الذي يغطي الدماغ والهوائي بلطف.
لدراسة تفاعل محاور ORN الثنائية أو محاور ORN مع استهداف تغصن PN ، قم بقطع العصب الهوائي أثناء المرحلة عن طريق وضع شفرات المقص الدقيق بعناية بين البشرة والدماغ وقطع العصب الهوائي المهتم. لنقل الإكسبورد التشريحي إلى صفيحة سيلغارد ، ضع ما يقرب من 200 ميكرولتر قطرة من الوسط الكامل المؤكسج على سطح سيلغارد. ماصة الجسم الدهني المشتق من الجذع التشريحي عدة مرات من خلال طرف ماصة 200 ميكرولتر لطلاء السطح الداخلي لمنع النباتات من الالتصاق بطرف الماصة أثناء النقل من التشريح جيدا إلى القطرة المتوسطة على صفيحة سيلغارد.
استخدم الملقط لتثبيت الإكسبورد على طبقة سيلغارد في الفصين البصريين ، ثم ضع صفيحة سيلغارد بعناية على محطة التصوير ، وشل حركة اللوحة بالأشرطة ، وأضف ببطء 10 ملليلتر من الوسط الكامل المؤكسج إلى لوحة سيلغارد باستخدام ماصة P1000. تصل محاور ORN إلى فص الهوائي بين 18 ساعة و 36 ساعة APF ثم تتنقل في فص الهوائي ، وتعبر خط الوسط وتبتكر الكبيبات. قبل التسجيل ، أظهرت المحاور العصبية بعض الانجراف الجانبي مع تطور الدماغ ، وبعد التسجيل ، تم تصحيح الانجراف.
تم الكشف عن الهويات الكبيبية لمحاور ORN المستخرجة عن طريق التلطيخ المناعي لعلامة neuropil و cadherin. من خلال المقارنة مع خريطة الفص الداخلية ، يمكن تحديد هوية كل كبيبة. أثناء الزراعة خارج الجسم الحي ، عادة ما يسبب نمو البكتيريا تطورا مريحا للدائرة الشمية.
لذلك ، من المهم تعقيم الطبق الثقافي والدبابيس قبل التصوير والحفاظ على غرفة التصوير نظيفة ومعزولة. لتحقيق دقة زمنية مكانية أعلى ، يمكن تصوير نظام explant هذا باستخدام مجهر أكثر تقدما ، وهو المجهر الضوئي الشبكي البصري التكيفي. على الرغم من أن تطوير دائرة المصنع قد تم عرضه هنا كمثال ، إلا أنه يمكن توسيع هذا النظام ليشمل دراسات الدوائر الأخرى والعمليات التنموية في الدماغ المركزي النامي.
