Este protocolo presenta un método para crear imágenes en vivo, volar el ensamblaje del circuito olfativo a nivel de un solo axón desde un cerebro en desarrollo. Disección Para limpiar el tejido que cubre el cerebro en desarrollo, podemos recopilar imágenes de alta calidad del cerebro interno. Este método proporciona información valiosa sobre la base biológica celular del desarrollo de circuitos.
Se puede modificar fácilmente para estudiar el desarrollo de otros circuitos también. Se necesita algún tiempo para que una persona realice un control manual estable en microdisección. Más práctica será útil.
Para comenzar, prepare el plato de cultivo para movilizar el explante durante la toma de imágenes de lapso de tiempo colocando Sylgard de 0,5 centímetros de espesor en la superficie inferior de una placa de Petri y dejándolo curar durante 48 horas a temperatura ambiente. Para preparar micro pines para inmovilizar el explante en esta placa usando pinzas, pegue múltiples micro pines en una cinta con los extremos afilados alineados en un lado y corte dos milímetros de extremos afilados con tijeras. Luego, usando las pinzas, inserte los micro pines cortados en la capa de Sylgard de una placa De Sylgard prefabricada.
Con un cepillo, recoja las pupas blancas, que forman pupario en una hora y transfiéralas a un nuevo vial. Incubar las pupas en el baño de agua templado a 37 grados centígrados durante 40 minutos para inducir clones de ORN escasos de tipos aleatorios. Después del choque térmico, coloque el vial a 25 grados centígrados durante 30 horas, lo que resulta en pupas envejecidas 30 horas después de la formación del pupario.
Luego prepare el medio de cultivo para explantar como se describe en el manuscrito de texto y guárdelo a cuatro grados centígrados. El día de la obtención de imágenes, agregue suero fetal bovino, solución madre de insulina humana y 20 solución madre de hidroxiecdisona que se disuelvan en etanol a un vial de 50 mililitros que contenga 45 mililitros del medio Drosophila de Schneider. Mezcle bien y transfiera 15 mililitros del medio completo en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y almacene el resto del medio completo a cuatro grados Celsius durante una semana.
Luego cubra la abertura de los tubos que contiene el medio completo con película de parafina y oxigene el medio bombeando burbujas de oxígeno debajo de la superficie del líquido a través de una punta de pipeta estéril de cinco mililitros a razón de una burbuja por segundo durante 20 a 30 minutos. A continuación, esterilizar la superficie del pozo de disección y preparar previamente la placa Sylgard con etanol al 70% y dejar secar antes de su uso. Use un cepillo para transferir 30 horas de pupa APF a un papel de seda para secar la superficie externa de la pupa durante cinco minutos.
Después de aplicar cinta adhesiva de doble cara en un portaobjetos de vidrio, fije cuidadosamente la pupa seca a la superficie pegajosa de la cinta con el lado dorsal hacia arriba. Presione suavemente la pupa con un cepillo para unir correctamente el lado ventral a la cinta sin dañar la pupa. Inserte una punta afilada de las pinzas entre la caja de pupa marrón y la pupa desde el lado lateral y rompa cuidadosamente la caja de pupa marrón a través de una línea hasta el extremo posterior de la pupa.
Una vez que se abre la caja de pupa marrón, usando los fórceps, sostenga suavemente la pupa y transfiérala al pozo de disección que contiene un mililitro de medio completo oxigenado. Sumerja la pupa en el medio para hundirla en el fondo del pozo. Para diseccionar el explante cerebral de la antena de la pupa, sostenga suavemente la pupa usando fórceps con una mano y usando un par de microescisoras, cree un pequeño orificio desde el lado posterior de la pupa, que libera alta presión dentro de la pupa.
Comenzando desde el agujero, corte a través de la línea media ventral hasta el cuello, luego corte a través de la circunferencia del cuello para separar la cabeza del cuerpo de la pupa y colocar el cuerpo en un pozo diferente. A continuación, corte la cutícula transparente que cubre el lado dorsal del cerebro para exponer el cuerpo graso en la parte superior del cerebro, asegurándose de mantener la cutícula a la que se unen la retina y la antena y, de manera similar, corte la cutícula del lado ventral del cerebro. Pipetee el medio hacia las regiones abiertas en los lados dorsal y ventral de la cabeza usando una pipeta P10 para lavar suavemente el cuerpo graso que cubre el cerebro y la antena.
Para estudiar la interacción de los axones ORN bilaterales o los axones ORN con la orientación de la dendrita PN, corte el nervio antenal durante la etapa colocando cuidadosamente las cuchillas de las microescisoras entre la cutícula y el cerebro y el nervio antenal interesado. Para transferir el explante disecado a la placa de Sylgard, coloque aproximadamente 200 gotas de microlitros del medio completo oxigenado en la superficie de Sylgard. Pipetear el cuerpo graso derivado del tronco diseccionado varias veces a través de una punta de pipeta de 200 microlitros para revestir la superficie interna para evitar que los explantes se peguen a la punta de la pipeta durante la transferencia del pozo de disección a la gota mediana en la placa de Sylgard.
Use las pinzas para fijar el explante en la capa de Sylgard en los dos lóbulos ópticos, luego coloque cuidadosamente la placa de Sylgard en la estación de imágenes, inmovilice la placa con cintas y agregue lentamente 10 mililitros del medio completo oxigenado a la placa de Sylgard usando una pipeta P1000. Los axones ORN llegan al lóbulo antenal entre 18 horas y 36 horas APF y luego navegan por el lóbulo antenal, cruzan la línea media e innovan los glomérulos. Antes del registro, los axones exhibían cierta deriva lateral a medida que el cerebro se desarrollaba, y después del registro, la deriva se corregía.
Las identidades glomerulares de los axones ORN extraídos se revelaron mediante la inmunotinción de un marcador neuropil y cadherina. Al comparar con el mapa del lóbulo interno, se pudo determinar la identidad de cada glomérulo. Durante el cultivo ex vivo, el crecimiento de bacterias generalmente causa un desarrollo descansado del circuito olfativo.
Por lo tanto, es importante esterilizar a fondo el plato cultural y los alfileres antes de la toma de imágenes y mantener la sala de imágenes limpia y aislada. Para lograr una mayor resolución temporal espacial, este sistema de explante se puede obtener utilizando un microscopio más avanzado, el microscopio de luz de red óptica adaptativa. Aunque aquí se mostró un desarrollo de circuito de fábrica como ejemplo, este sistema puede potencialmente expandirse a estudios de otros circuitos y procesos de desarrollo en el cerebro central en desarrollo.
