이 프로토콜은 살아있는 이미지, 발달하는 두뇌에서 단일 축삭 수준에서 후각 회로 어셈블리를 비행하는 방법을 제시합니다. 개발 뇌를 덮고있는 조직을 청소하기 위해 해부, 우리는 내부 뇌에서 고품질의 이미지를 수집 할 수 있습니다. 이 방법은 회로 개발의 세포 생물학적 기초에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.
다른 회로의 개발을 연구하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다. 사람이 미세 해부에서 안정적인 손 제어를 수행하는 데는 약간의 시간이 걸립니다. 더 많은 연습이 도움이 될 것입니다.
먼저 페트리 접시의 바닥면에 0.5cm 두께의 실가드를 깔고 상온에서 48시간 동안 경화시켜 타임랩스 이미징 동안 외식편을 동원하기 위한 배양 접시를 준비한다. 포셉을 사용하여 이 플레이트에 explant를 고정시키기 위한 마이크로 핀을 준비하려면 한쪽에 날카로운 끝이 정렬된 테이프에 여러 개의 마이크로 핀을 붙이고 가위로 두 밀리미터의 날카로운 끝을 자릅니다. 그런 다음 포셉을 사용하여 절단 된 마이크로 핀을 미리 만들어진 Sylgard 플레이트의 Sylgard 층에 삽입하십시오.
브러시를 사용하여 한 시간 안에 번데기를 형성하는 흰 번데기를 모아 새 약병으로 옮깁니다. 번데기를 섭씨 37도에서 40분 동안 템퍼링된 수조에서 인큐베이션하여 무작위 유형으로부터 희소 ORN 클론을 유도한다. 열 충격 후, 바이알을 섭씨 25도에 30 시간 동안 두어 번데기 형성 후 30 시간 동안 번데기가 숙성됩니다.
그런 다음 텍스트 원고에 설명 된대로 explant를위한 배양 배지를 준비하고 섭씨 네 도에 보관하십시오. 이미징 당일, 태아 소 혈청, 인간 인슐린 원액 및 에탄올에 용해된 20개의 하이드록시에크디손 원액을 슈나이더 초파리 배지 45밀리리터가 들어있는 50밀리리터 바이알에 첨가한다. 잘 섞어서 전체 매체 15 밀리리터를 새로운 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 나머지 전체 매체를 섭씨 4도에 일주일 동안 보관하십시오.
이어서, 전체 배지를 함유하는 튜브 개구부를 파라핀 필름으로 덮고, 20 내지 30분 동안 초당 하나의 기포의 속도로 멸균된 오밀리리터 피펫 팁을 통해 액체 표면 아래에 산소 버블을 펌핑함으로써 배지를 산소화한다. 다음으로, 해부 우물 표면을 살균하고 이전에 준비된 Sylgard 플레이트를 70 % 에탄올로 소독하고 사용 전에 건조시킵니다. 브러시를 사용하여 30 시간 APF 번데기를 티슈 페이퍼로 옮겨 번데기의 외부 표면을 5 분 동안 건조시킵니다.
유리 슬라이드에 양면 테이프를 적용한 후 말린 번데기를 등쪽이 위쪽을 향하게하여 테이프의 끈적 끈적한 표면에 조심스럽게 부착했습니다. 번데기를 브러시로 부드럽게 눌러 번데기를 손상시키지 않고 복부 측면을 테이프에 올바르게 부착하십시오. 갈색 번데기 케이스와 번데기 사이에 포셉의 날카로운 팁 하나를 옆쪽에서 삽입하고 번데기의 후부 끝까지의 선을 통해 갈색 번데기 케이스를 조심스럽게 부수십시오.
갈색 번데기 케이스가 열리면 포셉을 사용하여 번데기를 부드럽게 잡고 산소가 함유 된 전체 배지 한 밀리리터가 들어있는 해부 우물로 옮깁니다. 번데기를 배지에 담그고 우물 바닥에 가라 앉히십시오. 번데기에서 안테나 뇌를 해부하려면 한 손으로 포셉을 사용하여 번데기를 부드럽게 잡고 한 쌍의 미세 가위를 사용하여 번데기 안쪽에 높은 압력을 방출하는 번데기의 뒤쪽에서 작은 구멍을 만듭니다.
구멍에서 시작하여 복부 미드 라인을 통해 목까지 자른 다음 목의 둘레를 잘라 번데기의 몸에서 머리를 분리하고 몸을 다른 우물에 놓습니다. 다음으로, 뇌의 등쪽을 덮고있는 투명한 큐티클을 잘라 뇌의 상부에 지방체를 노출시켜 망막과 안테나가 부착 된 큐티클을 유지하고 유사하게 뇌의 복부 쪽에서 큐티클을 자릅니다. P10 피펫을 사용하여 머리의 등쪽 및 복부 측면의 열린 영역을 향해 매체를 피펫하여 뇌와 안테나를 덮고있는 지방체를 부드럽게 씻어냅니다.
PN 수상 돌기 표적화에 대한 양측 ORN 축삭 또는 ORN 축삭의 상호 작용을 연구하기 위해, 큐티클과 뇌 사이에 미세 가위의 블레이드를 조심스럽게 배치하고 관심있는 안테나 신경을 절단하여 단계 동안 안테나 신경을 절단하십시오. 해부된 explant를 Sylgard 플레이트로 옮기려면 산소가 공급된 전체 배지의 약 200 마이크로리터 물방울을 Sylgard 표면에 놓습니다. 해부된 트렁크로부터 유래된 지방체를 200 마이크로리터 피펫 팁을 통해 여러 번 피펫 내부 표면을 코팅하여 해부로부터 실가드 플레이트 상의 배지 액적으로 이송하는 동안 외식편이 피펫 팁에 달라붙는 것을 방지한다.
포셉을 사용하여 두 개의 광학 로브의 Sylgard 층에 explant를 고정시킨 다음 Sylgard 플레이트를 이미징 스테이션에 조심스럽게 배치하고 테이프로 플레이트를 고정시킨 다음 P1000 피펫을 사용하여 산소가 공급된 전체 매체 10밀리리터를 Sylgard 플레이트에 천천히 추가합니다. ORN 축삭은 18 시간에서 36 시간 APF 사이에 안테나 엽에 도착한 다음 안테나 엽을 탐색하고 미드 라인을 건너 사구체를 혁신합니다. 등록 전에, 축삭은 뇌가 발달함에 따라 약간의 측면 표류를 나타 냈고, 등록 후 표류가 수정되었습니다.
추출된 ORN 축색돌기의 사구체 동일성은 뉴로필 마커 및 카데린의 면역염색에 의해 밝혀졌다. 내부 엽 지도와 비교함으로써, 각 사구체의 정체가 결정될 수 있었다. 생체외 배양 동안, 박테리아 성장은 보통 후각 회로의 휴식 발달을 일으킨다.
따라서 영상화 전에 문화용 접시와 핀을 철저히 살균하고 영상실을 깨끗하고 격리된 상태로 유지하는 것이 중요하다. 더 높은 공간 시간 분해능을 달성하기 위해,이 explant 시스템은 적응 광학 격자 광 현미경 인 고급 현미경을 사용하여 이미징 할 수 있습니다. 공장 회로 개발이 예로 여기에 표시되었지만,이 시스템은 잠재적으로 개발 중추 뇌의 다른 회로 및 발달 과정에 대한 연구로 확장 될 수 있습니다.
