Este protocolo apresenta um método para viver a imagem, voar olfactory circuit assembly a um único nível de axônio a partir de um cérebro em desenvolvimento. dissecção para limpar o tecido que cobre o cérebro em desenvolvimento, podemos coletar imagens de alta qualidade do cérebro interno. Este método fornece insights valiosos sobre a base biológica celular do desenvolvimento do circuito.
Pode ser facilmente modificado para estudar o desenvolvimento de outros circuitos também. Leva algum tempo para uma pessoa realizar um controle manual estável na microdisseção. Mais prática será útil.
Para começar, prepare a placa de cultura para mobilizar a explant durante a imagem de lapso de tempo colocando Sylgard de 0,5 centímetros de espessura na superfície inferior de uma placa de Petri e deixando-a curar por 48 horas à temperatura ambiente. Para preparar micro pinos para imobilizar a explantagem nesta placa usando fórceps, coloque vários micro pinos em uma fita com as pontas afiadas alinhadas de um lado e corte dois milímetros de pontas afiadas com uma tesoura. Em seguida, usando os fórceps, insira os micro pinos cortados na camada Sylgard de uma placa Sylgard pré-feita.
Usando um pincel, colete pupas brancas, que formam puparium dentro de uma hora e transfiram-nas para um novo frasco. Incubar a pupa no banho de água temperada a 37 graus Celsius por 40 minutos para induzir clones orn esparsos de tipos aleatórios. Após o choque térmico, coloque o frasco a 25 graus Celsius por 30 horas, resultando em pupas com 30 horas após a formação do puparium.
Em seguida, prepare o meio de cultura para explantar como descrito no manuscrito do texto e armazenar a quatro graus Celsius. No dia da imagem, adicione soro bovino fetal, solução de estoque de insulina humana e 20 soluções de estoque de hidroxiecdysona se dissolvem em etanol a um frasco de 50 mililitros contendo 45 mililitros do meio Drosophila de Schneider. Misture bem e transfira 15 mililitros do meio completo em um novo tubo cônico de 50 mililitros e armazene o resto do meio completo a quatro graus Celsius por uma semana.
Em seguida, cubra os tubos abrindo contendo meio completo com filme de parafina e oxigene o meio bombeando bolhas de oxigênio sob a superfície líquida através de uma ponta de pipeta de cinco mililitros estéreis à taxa de uma bolha por segundo por 20 a 30 minutos. Em seguida, esterilize a superfície do poço de dissecção e prepare-se previamente com placa Sylgard com 70% de etanol e deixe-as secar antes do uso. Use uma escova para transferir pupa APF de 30 horas para um papel de tecido para secar a superfície externa da pupa por cinco minutos.
Depois de aplicar fita dupla face em um slide de vidro, cuidadosamente anexado a pupa seca à superfície pegajosa da fita com o lado dorsal voltado para cima. Pressione suavemente a pupa com um pincel para fixar corretamente o lado ventral à fita sem danificar a pupa. Insira uma ponta afiada das fórceps entre a caixa de pupal marrom e a pupa do lado lateral e quebre cuidadosamente a caixa de pupal marrom através de uma linha até a extremidade posterior da pupa.
Uma vez que a caixa de pupal marrom é aberta, usando as fórceps, segure suavemente a pupa e transfira-a para o poço de dissecção contendo um mililitro de meio completo oxigenado. Submergir a pupa no meio por afundá-la até o fundo do poço. Para dissecar a explanta cerebral da antena da pupa, segure suavemente a pupa usando fórceps com uma mão e usando um par de microscisores, crie um pequeno buraco do lado posterior da pupa, que libera alta pressão dentro da pupa.
Partindo do orifício, corte a linha média ventral até o pescoço, depois corte através da circunferência do pescoço para desprender a cabeça do corpo da pupa e colocar o corpo em um poço diferente. Em seguida, corte a cutícula transparente que cobre o lado dorsal do cérebro para expor o corpo de gordura em cima do cérebro, garantindo manter a cutícula à qual a retina e a antena se prendem e, da mesma forma, cortar a cutícula do lado ventral do cérebro. Pipeta o meio em direção às regiões abertas nas laterais dorsal e ventral da cabeça usando uma pipeta P10 para lavar suavemente o corpo de gordura cobrindo o cérebro e a antena.
Para estudar a interação de axônios orn bilaterais ou axônios ORN com o alvo de dendrite PN, corte o nervo antena durante o estágio, colocando cuidadosamente as lâminas dos microscisores entre a cutícula e o cérebro e corte o nervo antena interessado. Para transferir a explanta dissecada para a placa Sylgard, coloque aproximadamente 200 microliters gotículas do meio total oxigenado na superfície Sylgard. Pipeta o corpo de gordura derivado do tronco dissecado várias vezes através de uma ponta de pipeta de 200 microliter para revestir a superfície interna para evitar que as explantas grudem na ponta da pipeta durante a transferência da dissecação bem para a gotícula média na placa Sylgard.
Use as fórceps para fixar a explanta na camada Sylgard nos dois lóbulos ópticos, em seguida, posicione cuidadosamente a placa de Sylgard na estação de imagem, imobilize a placa com fitas e adicione lentamente 10 mililitros do meio oxigenado completo à placa Sylgard usando uma pipeta P1000. Os axônios orn chegam ao lóbulo antenal entre 18 horas e 36 horas APF e depois navegam pelo lobo antena, cruzam a linha média e inovam o glomeruli. Antes do registro, os axônios exibiam alguns desvios laterais à medida que o cérebro se desenvolveu, e após o registro, a deriva foi corrigida.
As identidades glomerulares dos axônios ORN extraídos foram reveladas pela imunostenção de um marcador neuropil e cadherin. Comparando-se com o mapa interno do lobo, a identidade de cada glomerulus poderia ser determinada. Durante a cultura ex vivo, o crescimento de bactérias geralmente causa um desenvolvimento de circuito olfativo.
Por isso, é importante esterilizar completamente o prato cultural e os pinos antes da imagem e manter a sala de imagem limpa e isolada. Para alcançar maior resolução temporal espacial, este sistema de explant pode ser imageado usando microscópio mais avançado, o microscópio de luz de rede óptica adaptativa. Embora o desenvolvimento de um circuito fabril tenha sido mostrado aqui como exemplo, esse sistema pode potencialmente ser expandido para estudos de outros circuitos e processos de desenvolvimento no cérebro central em desenvolvimento.
