פרוטוקול זה מציג שיטה לתמונה חיה, להעיף מכלול מעגלי חוש הריח ברמת אקסון יחיד ממוח מתפתח. דיסקציה כדי לנקות את הרקמה המכסה את המוח המתפתח, אנו יכולים לאסוף תמונות באיכות גבוהה מהמוח הפנימי. שיטה זו מספקת תובנות חשובות על הבסיס הביולוגי של התא של פיתוח מעגלים.
זה יכול להיות שונה בקלות כדי ללמוד את הפיתוח של מעגלים אחרים גם כן. לוקח זמן עד שאדם מבצע שליטה ידנית יציבה במיקרו-דיסקציה. תרגול נוסף יעזור.
כדי להתחיל, הכינו את צלחת התרבית לגיוס האקספלנט במהלך הדמיה בהילוך מהיר על ידי הנחת סילגארד בעובי 0.5 ס"מ על המשטח התחתון של צלחת פטרי ותנו לו לרפא במשך 48 שעות בטמפרטורת החדר. כדי להכין פיני מיקרו לשתוק האקספלנט על לוח זה באמצעות מלקחיים, הדביקו מספר פינים זעירים על סרט הדבקה כאשר הקצוות החדים מיושרים בצד אחד וחתכו שני מילימטרים של קצוות חדים במספריים. לאחר מכן באמצעות המלקחיים, הכנס את סיכות המיקרו החתוכים לשכבת סילגארד של צלחת סילגארד מוכנה מראש.
באמצעות מברשת, לאסוף גלמים לבנים, אשר יוצרים puparium בתוך שעה ולהעביר אותם בקבוקון חדש. דגירה של הגלמים באמבט המים הממוזגים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות כדי לגרום לשיבוטי ORN דלילים מסוגים אקראיים. לאחר הלם חום, מניחים את הבקבוקון על 25 מעלות צלזיוס למשך 30 שעות וכתוצאה מכך הגלמים מזדקנים 30 שעות לאחר היווצרות הגוריום.
לאחר מכן הכינו את מדיום התרבות לאקספלנט כפי שמתואר בכתב היד של הטקסט ואחסנו בארבע מעלות צלזיוס. ביום ההדמיה, הוסיפו סרום בקר עוברי, תמיסת מלאי אינסולין אנושית ו-20 תמיסת ציר הידרוקסיאקדיסון מתמוססת באתנול לבקבוקון 50 מיליליטר המכיל 45 מיליליטרים של מדיום דרוזופילה של שניידר. מערבבים היטב ומעבירים 15 מיליליטרים של המדיום המלא לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר ומאחסנים את שאר המדיום המלא בארבע מעלות צלזיוס למשך שבוע.
לאחר מכן מכסים את פתח הצינורות המכילים מדיום מלא עם סרט פרפין ומחמצנים את המדיום על ידי שאיבת בועות חמצן מתחת לפני השטח הנוזליים דרך קצה פיפטה סטרילי של חמישה מיליליטר בקצב של בועה אחת לשנייה למשך 20 עד 30 דקות. לאחר מכן, לעקר את משטח באר הנתיחה והוכן בעבר צלחת Sylgard עם 70% אתנול ולתת להם להתייבש לפני השימוש. השתמש במברשת כדי להעביר 30 שעות גולם APF לנייר טישו לייבוש המשטח החיצוני של הגלם במשך חמש דקות.
לאחר מריחת סרט דו-צדדי על מגלשת זכוכית, חיבר בזהירות את הגלם המיובש למשטח הדביק של הסרט כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה. לחץ בעדינות על הגלם עם מברשת כדי לחבר כראוי את הצד הגחוני לסרט מבלי לפגוע בגולם. מכניסים קצה חד אחד של המלקחיים בין נרתיק הפופל החום לגולם מהצד הצדדי ושוברים בזהירות את נרתיק הפופל החום דרך קו לקצה האחורי של הגלם.
לאחר פתיחת מארז הפופל החום, באמצעות המלקחיים, החזיקו בעדינות את הגלם והעבירו אותו לבאר הנתיחה המכילה מיליליטר אחד של מדיום מלא מחומצן. הטביעו את הגלם במדיום להטבעתו לתחתית הבאר. כדי לנתח את מוח האנטנה מהגלמים, החזיקו בעדינות את הגלם באמצעות מלקחיים ביד אחת ובאמצעות זוג מיקרו-חתכים, צרו חור קטן מהצד האחורי של הגלם, אשר משחרר לחץ גבוה בתוך הגלם.
החל מהחור, חתכו דרך קו האמצע הגחוני עד הצוואר, ואז חתכו את היקף הצוואר כדי לנתק את הראש מגוף הגלם ולהניח את הגוף בבאר אחרת. לאחר מכן, חותכים את הציפורן השקופה המכסה את הצד הגבי של המוח כדי לחשוף את הגוף השמן על גבי המוח, ומבטיחים לשמור על הציפורן שאליה מתחברות הרשתית והאנטנה ובאופן דומה, לחתוך את הציפורן מהצד הגחוני של המוח. פיפטה את המדיום לכיוון האזורים הפתוחים בצד הגבי והגחוני של הראש באמצעות פיפטה P10 כדי לשטוף בעדינות את הגוף השמן המכסה את המוח והאנטנה.
כדי לחקור את האינטראקציה של אקסונים דו-צדדיים של ORN או אקסונים של ORN למיקוד דנדריט PN, נתקו את עצב האנטנה במהלך השלב על ידי הצבת הלהבים של המיקרו-חתכים בין הציפורן למוח וניתוק עצב האנטנה המעוניין. להעברת האקספלנט המנותח לצלחת סילגארד, הניחו כ-200 טיפות מיקרוליטרים של המדיום המלא המחומצן על פני השטח של סילגארד. פיפטה הגוף השמן נגזר מהגזע המנותח מספר פעמים דרך קצה פיפטה 200 מיקרוליטר לציפוי המשטח הפנימי כדי למנוע מהמוציאים להידבק לקצה הפיפטה במהלך ההעברה מבאר הנתיחה אל הטיפה הבינונית שעל צלחת סילגארד.
השתמשו במלקחיים כדי להצמיד את האקספלנט לשכבת סילגארד בשתי האונות האופטיות, ואז מיקמו בזהירות את לוחית סילגארד על תחנת ההדמיה, שיתקו את הצלחת בקלטות, והוסיפו באיטיות 10 מיליליטרים של המדיום המלא המחומצן לצלחת סילגארד באמצעות פיפטה P1000. האקסונים של ORN מגיעים לאונת האנטנה בין 18 שעות ל-36 שעות APF ואז מנווטים באונה האנטנה, חוצים את קו האמצע ומחדשים את הגלומרולי. לפני הרישום, האקסונים הפגינו סחף רוחבי מסוים ככל שהמוח התפתח, ולאחר הרישום, הסחף תוקן.
הזהויות הגלומרולריות של האקסונים של ORN שחולצו נחשפו על ידי חיסון של סמן נוירופיל וקדהרין. על ידי השוואה למפת האונה הפנימית, ניתן היה לקבוע את זהותו של כל גלומרולוס. במהלך תרבית ex vivo, צמיחת חיידקים גורמת בדרך כלל להתפתחות נחה של מעגל חוש הריח.
לכן, יש צורך לעקר ביסודיות את המנה התרבותית והסיכות לפני ההדמיה ולשמור על חדר ההדמיה נקי ומבודד. להשגת רזולוציה טמפורלית מרחבית גבוהה יותר, ניתן לצלם את מערכת ההסבר הזו באמצעות מיקרוסקופ מתקדם יותר, מיקרוסקופ אור הסריג של האופטיקה האדפטיבית. אף על פי שהתפתחות מעגלי מפעל הוצגה כאן כדוגמה, ניתן להרחיב מערכת זו למחקרים של מעגלים אחרים ותהליכי התפתחות במוח המרכזי המתפתח.
