Bu protokol, görüntüyü yaşamak, gelişmekte olan bir beyinden tek akson seviyesinde koku devresi düzeneğini uçurmak için bir yöntem sunar. Diseksiyon gelişmekte olan beyni kaplayan dokuyu temizlemek, iç beyinden yüksek kaliteli görüntüler toplayabiliyoruz. Bu yöntem, devre gelişiminin hücre biyolojik temeli hakkında değerli bilgiler sağlar.
Diğer devrelerin gelişimini incelemek için kolayca değiştirilebilir. Bir kişinin mikrodiseksiyonda stabil el kontrolü yapması biraz zaman alır. Daha fazla uygulama yardımcı olacaktır.
Başlamak için, bir Petri kabının alt yüzeyine 0,5 santimetre kalınlığında Sylgard koyarak ve oda sıcaklığında 48 saat boyunca sertleşmesine izin vererek hızlandırılmış görüntüleme sırasında eksplantı harekete geçirmek için kültür kabını hazırlayın. Forseps kullanarak eksplantı bu plaka üzerinde hareketsiz hale getirmek için mikro pimler hazırlamak için, keskin uçları bir tarafa hizalanmış bir bant üzerine birden fazla mikro pim yapıştırın ve iki milimetrelik keskin uçları makasla kesin. Daha sonra forsepsleri kullanarak, kesilmiş mikro pimleri önceden hazırlanmış bir Sylgard plakasının Sylgard tabakasına yerleştirin.
Bir fırça kullanarak, bir saat içinde puparyum oluşturan beyaz pupaları toplayın ve bunları yeni bir şişeye aktarın. Rastgele tiplerden seyrek ORN klonlarını indüklemek için 40 dakika boyunca 37 santigrat derecede temperlenmiş su banyosundaki pupaları inkübe edin. Isı şokundan sonra, şişeyi 30 saat boyunca 25 santigrat dereceye yerleştirin, bu da puparyum oluşumundan 30 saat sonra pupalarla sonuçlanır.
Daha sonra kültür ortamını metin el yazmasında açıklandığı gibi eksplant için hazırlayın ve dört santigrat derecede saklayın. Görüntüleme gününde, fetal sığır serumu, insan insülin stok çözeltisi ve etanol içinde çözünen 20 hidroksiekdison stok çözeltisini, 45 mililitre Schneider'in Drosophila ortamını içeren 50 mililitrelik bir şişeye ekleyin. İyice karıştırın ve tam ortamın 15 mililitresini yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın ve tam ortamın geri kalanını bir hafta boyunca dört santigrat derecede saklayın.
Daha sonra tam ortam içeren tüpleri parafin film ile örtün ve sıvı yüzeyin altındaki oksijen kabarcıklarını steril beş mililitrelik pipet ucundan 20 ila 30 dakika boyunca saniyede bir kabarcık hızında pompalayarak ortamı oksijenlendirin. Daha sonra, diseksiyon kuyusu yüzeyini ve önceden hazırlanmış Sylgard plakasını% 70 etanol ile sterilize edin ve kullanmadan önce kurumasını bekleyin. Pupa'nın dış yüzeyini beş dakika kurutmak için 30 saatlik APF pupa'yı bir kağıt mendile aktarmak için bir fırça kullanın.
Bir cam slayt üzerine çift taraflı bant uyguladıktan sonra, kurutulmuş pupa'yı sırt tarafı yukarı bakacak şekilde bandın yapışkan yüzeyine dikkatlice tutturun. Pupaya zarar vermeden ventral tarafı banda düzgün bir şekilde tutturmak için pupaya hafifçe bir fırça ile bastırın. Forsepslerin keskin bir ucunu kahverengi pupa kasası ile pupa arasına lateral taraftan yerleştirin ve kahverengi pupa vakasını pupanın arka ucuna doğru bir çizgi boyunca dikkatlice kırın.
Kahverengi pupa kılıfı açıldıktan sonra, forsepsleri kullanarak, pupayı yavaşça tutun ve bir mililitre oksijenli tam ortam içeren diseksiyon kuyusuna aktarın. Pupa'yı kuyunun dibine batırmak için ortama batırın. Anten beynini pupadan çıkarmak için, pupayı bir elinizle forseps kullanarak ve bir çift mikromakas kullanarak yavaşça tutun, pupanın arka tarafından küçük bir delik oluşturun, bu da pupanın içinde yüksek basınç salgılar.
Delikten başlayarak, ventral orta çizgiden boyuna kadar kesin, daha sonra kafayı pupa'nın gövdesinden ayırmak ve vücudu farklı bir kuyuya yerleştirmek için boynun çevresini kesin. Daha sonra, beynin üstündeki yağ gövdesini açığa çıkarmak için beynin dorsal tarafını kaplayan şeffaf kütikülü kesin, retina ve antenin bağlandığı kütikülü tutmayı sağlayın ve benzer şekilde kütikülü beynin ventral tarafından kesin. Beyni ve anteni kaplayan yağ gövdesini nazikçe yıkamak için bir P10 pipet kullanarak ortamı başın dorsal ve ventral taraflarındaki açık bölgelere doğru pipetleyin.
İki taraflı ORN aksonları veya ORN aksonlarının PN dendrit hedefleme ile etkileşimini incelemek için, mikromakasın bıçaklarını kütikül ve beyin arasına dikkatlice yerleştirerek anten sinirini kesin ve ilgilenen anten sinirini ayırın. Disseke edilmiş eksplantı Sylgard plakasına aktarmak için, oksijenli tam ortamın yaklaşık 200 mikrolitre damlacığını Sylgard yüzeyine yerleştirin. Diseksiyon kuyusundan Sylgard plakasındaki orta damlacığa transfer sırasında eksplantların pipet ucuna yapışmasını önlemek için iç yüzeyi kaplamak üzere disseke edilmiş gövdeden elde edilen yağ gövdesini birkaç kez pipetleyin.
Explant'ı iki optik lobdaki Sylgard tabakasına sabitlemek için forsepsleri kullanın, ardından Sylgard plakasını görüntüleme istasyonuna dikkatlice yerleştirin, plakayı bantlarla hareketsiz hale getirin ve bir P1000 pipet kullanarak Sylgard plakasına yavaşça 10 mililitre oksijenli tam ortam ekleyin. ORN aksonları anten lobuna 18 saat ile 36 saat APF arasında ulaşır ve daha sonra anten lobunu yönlendirir, orta çizgiyi geçer ve glomerülleri yeniler. Kayıttan önce, aksonlar beyin geliştikçe bir miktar yanal sürüklenme sergiledi ve kayıttan sonra sürüklenme düzeltildi.
Ekstrakte edilen ORN aksonlarının glomerüler kimlikleri, bir nöropil belirteci ve kadherinin immün boyanması ile ortaya çıkarıldı. İç lob haritası ile karşılaştırılarak, her glomerulusun kimliği belirlenebilir. Ex vivo kültür sırasında, bakteri büyümesi genellikle koku alma devresinin dinlenmiş bir gelişimine neden olur.
Bu nedenle, görüntülemeden önce kültürel çanağı ve pimleri iyice sterilize etmek ve görüntüleme odasını temiz ve izole tutmak önemlidir. Daha yüksek uzamsal zamansal çözünürlük elde etmek için, bu eksplant sistemi daha gelişmiş mikroskop, uyarlanabilir optik kafes ışık mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir. Burada örnek olarak bir fabrika devresi gelişimi gösterilse de, bu sistem potansiyel olarak gelişmekte olan merkezi beyindeki diğer devrelerin ve gelişimsel süreçlerin çalışmalarına genişletilebilir.
