يسمح لنا استخدام الحقن المجهري لتوصيل بنى الحمض النووي إلى Strongyloides بتوليد الضربات القاضية والمعدلة وراثيا ، والتي يمكن استخدامها لدراسة كيفية تطور هذه الديدان ، والتنقل في بيئتها ، وتطفل المضيفين. حتى الآن ، هذه هي التقنية الناجحة الوحيدة لتوليد الضربات القاضية والمعدلة وراثيا في هذه الطفيليات. قبل يوم واحد من الحقن المجهري ، أضف 180 ميكرولتر من محلول الأغاروز على زلة غطاء باستخدام ماصة باستور الزجاجية ، ثم أسقط على الفور زلة غطاء ثانية في الأعلى لتسطيح الأغاروز في وسادة رقيقة.
بعد 5 إلى 10 ثوان ، قم بإزالة زلة الغطاء العلوي عن طريق تحريك الاثنين بعيدا وتحديد الشريحة التي توجد عليها لوحة الأجار ، ووضعها وجها لوجه. ثم حدد قطعة صغيرة من شظية الزجاج من زلة غطاء مكسورة ، وباستخدام الملقط ، اضغط عليها برفق في الأجار بالقرب من الحافة العلوية للوسادة. في يوم الحقن المجهري ، قم بتبطين حامل Baermann ، وهو غربال مصنوع من حلقتين بلاستيكيتين مع طبقتين من شبكة النايلون المثبتة بينهما بثلاث قطع متداخلة من أنسجة المختبر.
ثم يضاف خليط الفحم البرازي إلى حامل بيرمان. بعد ذلك ، ضع حامل Baermann مع خليط البراز والفحم في القمع ، وقم بطي قطع الأنسجة حول مزيج البراز والفحم ، وأضف ما يكفي من الماء لغمر معظم الفحم البرازي. بعد ذلك ، قم بتغطية القمع بغطاء طبق بتري بلاستيكي بطول 15 سم لاحتواء الرائحة ووضع علامة على القمع حسب الحاجة.
بعد ساعة إلى ساعتين ، أمسك بأنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر تحت الأنابيب المطاطية في الجزء السفلي من القمع وافتح المشابك بعناية في الجزء السفلي لتوزيع 30 إلى 40 ملليلتر من الماء المحتوي على الديدان في أنبوب 50 ملليلتر. ثم. نقل 15 ملليلتر من مياه بيرمان التي تحتوي على الديدان إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر. قم بتدوير الأنبوب ، وقم بإزالة ما يصل إلى 13 ملليلتر من السوبرناتانت ، وتخلص منه في حاوية نفايات سائلة مع اليود لقتل أي ديدان.
بعد جمع جميع الديدان ، افحص حبيبات الديدان في قاع الأنبوب. إذا لم تكن هناك ديدان مرئية ، فانتظر لمدة ساعة إلى ساعتين ثم اجمع المزيد من الديدان من جهاز بيرمان. انقل الديدان في أقل قدر ممكن من الماء إلى صفيحة متوسطة النمو من الديدان الخيطية سعة ستة سنتيمترات 2٪ مع حديقة من E.coli HB101 واستخدم هذه اللوحة كلوحة مصدر للحقن المجهري.
تحت المجهر التشريحي ، قم بتغطية شظية الزجاج على غطاء وسادة الحقن المجهري بزيت الهالوكربون باستخدام اختيار دودة البلاتين القياسية. ثم ، ضع غطاء وسادة الحقن المجهري على منظار الحقن المجهري وحدد موقع شظية الزجاج المغطى بالزيت. قم بمحاذاة شظية الزجاج بحيث تكون الحافة عمودية على اتجاه الإبرة لتكون بمثابة السطح المستخدم لكسر الإبرة.
بعد ذلك ، باستخدام مجهر تشريح ، تأكد من أن الإبرة لا تحتوي على فقاعات أو حطام في العمود المدبب ، ثم قم بتأمين الإبرة من 1 إلى 1.5 سم في الحامل المضغوط. ضع طرف الإبرة في وسط مجال رؤية المجهر بالعين وتحت تكبير منخفض ، ضع طرف الإبرة في مجال الرؤية عموديا على جانب شظية الزجاج. ثم ، قم بالتبديل إلى تكبير أعلى ومحاذاة طرف الإبرة مع حافة الزجاج ، بالقرب منه ، ولكن دون لمسه.
بعد ذلك ، لكسر طرف الإبرة والسماح بتدفق السائل ، انقر برفق على الإبرة على جانب قطعة الزجاج أثناء تطبيق ضغط مستمر من الغاز. بمجرد أن يبدأ السائل في التدفق ، تحقق من شكل الطرف وتأكد من أنه حاد مع سائل سهل التدفق. عندما يتدفق السائل جيدا من الإبرة ، حرك شريحة الحقن المجهري إلى نطاق التشريح وأضف ميكرولترا إلى ميكرولترين من زيت الهالوكربون على وسادة الأجار لوضع الديدان.
انقل 20 إلى 30 شابا بالغا من Strongyloides إلى صفيحة متوسطة النمو للديدان الخيطية بنسبة 2٪ بدون بكتيريا لمدة خمس دقائق على الأقل لإزالة البكتيريا السطحية الزائدة واختيار الديدان المفردة للحقن المجهري. أضف المزيد من الديدان إلى اللوحة حسب الحاجة أثناء الحقن. باستخدام كمية صغيرة من زيت الهالوكربون على مختار دودة ، اختر أنثى شابة بالغة من Strongyloides مع بيضة إلى أربع بيضات في غددها التناسلية من اللوحة بدون بكتيريا ونقل الدودة إلى قطرة صغيرة من الزيت على وسادة الأجار.
باستخدام اختيار الدودة ، ضع الدودة بلطف حتى لا يتم لفها وتكون الغدد التناسلية مرئية ويسهل الوصول إليها. بعد ذلك ، ضع الدودة في مجال رؤية مجهر الحقن المجهري ، مما يضمن أن الغدد التناسلية على نفس جانب الإبرة ووضعها بحيث تتصل الإبرة بالغدد التناسلية بزاوية طفيفة. بعد ذلك ، أحضر طرف الإبرة إلى جانب الدودة في نفس المستوى البؤري.
ثم ، بهدف الوصول إلى ذراع الغدد التناسلية بالقرب من منتصف الدودة ، أدخل الإبرة بلطف في الغدد التناسلية باستخدام حاقن دقيق. اضغط على الفور على الإبرة لملء ذراع الغدد التناسلية بالكامل بمحلول الحمض النووي. بعد حقن كمية كافية من السوائل ، قم بإزالة الإبرة ولاحظ أن الجرح يغلق.
كرر الإجراء مع الذراع الأخرى للغدد التناسلية ، إذا كان مرئيا. بمجرد اكتمال الحقن ، تحقق بسرعة من عدم انسداد الإبرة عن طريق الضغط بطرف الإبرة على وسادة الأجار ، ثم انقل الشريحة مع الدودة المحقونة إلى المجهر التشريحي. لاستعادة الدودة المحقونة ، ضع أولا بضع قطرات من المياه المالحة العازلة للدودة على الدودة لتعويمها من وسادة الأجار.
ثم جمع كمية صغيرة من البكتيريا على اختيار دودة ولمس الدودة مع البكتيريا الملتصقة لإزالتها من السائل. انقل الدودة بلطف إلى لوحة الاسترداد. بالنسبة للتجارب السلوكية ، قم بنقل 20 إلى 30 يرقة إلى صفيحة متوسطة النمو الخيطية بنسبة 2٪ مع حديقة بكتيريا HB101 سميكة ، وتحت مجهر تشريح التألق ، حدد اليرقات التي تعبر عن الجين المتحول محل الاهتمام.
ثم ، باستخدام اختيار الدودة ، حدد اليرقات المعدلة وراثيا وضعها في كوب ساعة صغير مع محلول ملحي مخزن بالدودان. بالنسبة للفحص المجهري ، باستخدام شفرة حلاقة ، قم بتسجيل شبكة على الجزء السفلي البلاستيكي للوحة chemotaxis بطول 10 سنتيمترات لتتبع موقع الديدان على اللوحة بسهولة. بعد ذلك ، أضف ثلاثة ميكرولترات من اليرقات في محلول ملحي مخزن مؤقتا بالديدان إلى مربع على الشبكة ، وملء أكبر عدد ممكن من المربعات حسب الحاجة.
ثم أضف قطرات من 15 إلى 20 ميكرولتر من 1٪ من النيكوتين في الماء إلى قطرات الدودة. بعد أربع دقائق ، عندما تكون الديدان مشلولة ، قم بفحصها باستخدام مجهر تشريح فلوري. تظهر هنا يرقات ستيركولاريس Strongyloides المعدلة وراثيا مع نمط تعبير غير مكتمل وكامل act-2 mRFPmars.
التعبير غير المكتمل في عضلة جدار الجسم أكثر شيوعا عندما لا يتم دمج الجين المتحول في الجينوم. في المقابل، غالبا ما يشير التعبير المتسق في جميع أنحاء عضلة جدار الجسم إلى أن الجين المحور قد اندمج في الجينوم. الخطوة الرئيسية هي وضع الإبرة في نفس مستوى التركيز مثل الغدد التناسلية لضمان حقن الحمض النووي في الغدد التناسلية وسيتم دمجه في البويضات النامية.
وقد مكن تطوير هذه التقنية من دراسة وظيفة الجينات في الديدان الخيطية الطفيلية، التي توفر رؤى جديدة حول آليات التطفل والتفاعلات بين الطفيليات المضيفة.
