マイクロインジェクションを使用してDNA構築物をストロンギロイデスに送達することで、ノックアウトとトランスジェニックを生成することができ、これらのワームがどのように発達し、環境をナビゲートし、宿主に寄生するかを研究するために使用できます。これまでのところ、これはこれらの寄生虫にノックアウトとトランスジェニックを生成するための唯一の成功した技術です。マイクロインジェクションの1日前に、ガラスパスツールピペットを使用して180マイクロリットルのアガロース溶液をカバースリップに加え、すぐに2番目のカバースリップを上に落としてアガロースを薄いパッドに平らにします。
5~10秒後、2つをスライドさせてトップカバースリップを取り外し、寒天パッドがどちらがオンになっているかを確認し、上を向いて置きます。次に、壊れたカバースリップから小さなガラス片を選択し、鉗子を使用して、パッドの上端近くの寒天に静かに押し込みます。マイクロインジェクションの日に、2つのプラスチックリングで作られたふるいであるBaermannホルダーに、2つの層のナイロンチュイルネットが3つの重なり合ったラボ組織で固定されています。
次に、糞便 - 木炭混合物をBaermannホルダーに加える。次に、糞便 - 木炭混合物を含むBaermannホルダーを漏斗に置き、糞便 - 木炭混合物の周りに組織の断片を折り畳み、そして糞便炭の大部分を沈めるのに十分な水を加える。次に、漏斗の上に15センチメートルのプラスチック製のペトリ皿蓋を付けて臭いを封じ込め、必要に応じて漏斗にラベルを付けます。
1〜2時間後、漏斗の底にあるゴムチューブの下に50ミリリットルの遠沈管を持ち、底部のクランプを慎重に開いて、ワームを含む30〜40ミリリットルの水を50ミリリットルのチューブに分配します。そうしたら。ワームを含む15ミリリットルのバールマン水を15ミリリットルの遠沈管に移す。チューブを回転させ、最大13ミリリットルの上清を除去し、ヨウ素を含む液体廃棄物容器に捨ててワームを殺す。
すべてのワームを集めた後、チューブの底にあるワームのペレットを検査します。ワームが見えない場合は、1〜2時間待ってから、Baermann装置からさらにワームを収集します。大腸菌HB101の芝生を備えた6センチメートルの2%線虫増殖培地プレートにできるだけ少ない水でワームを移し、このプレートをマイクロインジェクションのソースプレートとして使用する。
解剖顕微鏡下で、マイクロインジェクションパッドカバースリップ上のガラスの破片を、標準的なプラチナワームピックを使用してハロカーボンオイルで覆います。次に、マイクロインジェクションパッドカバースリップをマイクロインジェクションスコープの上に置き、オイルで覆われたガラスの破片を見つけます。針の方向に対してエッジが垂直になるようにガラスの破片を揃えて、針を壊すために使用する表面として機能します。
次に、解剖顕微鏡を用いて、針にテーパーシャフトに気泡や破片がないことを確認し、針を加圧ホルダーに1〜1.5センチメートル固定する。針の先端を低倍率下で目線で顕微鏡視野の中央に配置し、ガラスシャードの側面に垂直な視野内に針の先端を配置する。次に、より高い倍率に切り替えて、針の先端をガラスの端に近づけますが、触れないようにします。
次に、針の先端を壊して液体の流れを可能にするために、気体から連続的な圧力をかけながら、ガラス片の側面にある針を静かに叩きます。液体が流れ始めたら、先端の形状を確認し、流れやすい液体で鋭利であることを確認してください。液体が針からよく流れたら、マイクロインジェクションスライドを解剖スコープに移動し、寒天パッドに1〜2マイクロリットルのハロカーボンオイルを加えてワームを配置します。
20〜30匹の若年成人ストロンギロイデスを細菌を含まない2%線虫増殖培地プレートに少なくとも5分間移し、過剰な表面細菌を除去し、マイクロインジェクション用の単一ワームを選択する。注入中に必要に応じてプレートにワームを追加します。ワームピックに少量のハロカーボンオイルを使用して、バクテリアなしでプレートから生殖腺に1〜4個の卵を持つストロンギロイデスのヤングアダルト女性を選択し、ワームを寒天パッド上の小さな油滴に移します。
ワームピックを使用して、ワームがコイル状にならず、生殖腺が見えてアクセスしやすいように、ワームを静かに配置します。次に、マイクロインジェクション顕微鏡の視野にワームを配置し、生殖腺が針と同じ側にあることを確認し、針がわずかな角度で生殖腺に接触するように配置します。次に、針の先端を同じ焦点面内のワームの側面に持って行きます。
次に、ワームの中央付近の生殖腺アームを目指し、マイクロインジェクターを用いて生殖腺に針を静かに挿入する。直ちに針に圧力をかけ、生殖腺アーム全体をDNA溶液で穏やかに充填する。十分な液体が注入された後、針を外し、創傷が閉じるのを観察します。
生殖腺のもう一方の腕で手順を繰り返します, それが見える場合.注射が完了したら、寒天パッドに針の先端で圧力をかけて針が詰まっていないことを素早く確認し、注入した虫の入ったスライドを解剖顕微鏡に移します。注入されたワームを回復するには、まずワームに数滴のワームバッファリング生理食塩水を置き、寒天パッドから浮かべます。
次に、ワームピックに少量の細菌を集め、付着した細菌でワームに触れて液体から取り除きます。ワームを回収プレートに静かに移します。行動実験のために、20〜30匹の幼虫を厚いHB101細菌芝生を有する2%線虫増殖培地プレートに移し、蛍光解剖顕微鏡下で、目的の導入遺伝子を発現する幼虫を同定する。
次に、ワームピックを使用して、トランスジェニック幼虫を選択し、ワーム緩衝生理食塩水を入れた小さな時計皿に入れます。顕微鏡観察では、カミソリの刃を使用して、10センチメートルの走化性プレートのプラスチック底面にグリッドをスコアリングし、プレート上のワームの位置を簡単に追跡します。次に、ワームバッファリングされた生理食塩水中の3マイクロリットルの幼虫をグリッド上の正方形に追加し、必要な数の正方形を埋める。
次に、15〜20マイクロリットルの水中の1%ニコチン滴をワーム滴に加える。4分後、ワームが麻痺したら、蛍光解剖顕微鏡を用いてそれらをスクリーニングする。不完全かつ完全なact-2 mRFPmars発現パターンを有するトランスジェニックストロンギロイデス・ステルコラリス幼虫がここに示されている。
体壁筋における斑状発現は、導入遺伝子がゲノムに組み込まれていない場合により一般的である。対照的に、体壁筋肉全体にわたって一貫した発現は、導入遺伝子がゲノムに組み込まれていることを示すことが多い。重要なステップは、DNAが生殖腺に注入され、発達中の卵に組み込まれるように、生殖腺と同じ焦点面に針を配置することです。
この技術の開発により、寄生性線虫の遺伝子機能の研究が可能となり、寄生のメカニズムや宿主-寄生虫相互作用に関する新たな知見がもたらされました。
