نود أن نعترف الروح التعاونية لجميع أفراد مختبر كالدويل. وقد تم دعم حركة البحث اضطرابات في المختبر من خلل التوتر باخمان شتراوس ومؤسسة باركنسون ، مؤسسة باركنسون المتحدة الأمريكية جمعية مرض باركنسون ، جمعية مرض باركنسون ولاية ألاباما ، وجيه مايكل فوكس مؤسسة للأبحاث مرض باركنسون ، والبحوث الجامعية.

البناء التعبير البلازميد مطلوبة البلازميدات اثنين : واحد للانسجة محددة التعبير عن الجينات في المصالح ، والمرتبة الثانية من حيث اختيار علامة التحول. التجريبية البلازميد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد المروج التي يعبر عنها في نوع النسيج / خلية من الاهتمام ، على سبيل المثال ، او العصب العضلات الخاصة المروج. إذا كان واحد هو التعبير عن جينات متعددة داخل النسيج نفسه ، ويمكن استخدام شريط المروج البلازميد في النظام عبارة (Invitrogen). هذا النهج يسمح للالإدراج في أي من الجين المصب مصلحة المروج بنسبة 4 الاستنساخ تهجيني وعموما ، 2-5 كيلو بايت من متواليات المنبع يكفي أن يكون تعبيرا صحيحا ودقيقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن استنساخ [كدنا] من الجينات ذات الاهتمام بطريقتين : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستنساخ التقليدية باستخدام إنزيمات التقييد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عبارة عن الاستنساخ ، هو تضخيم PCR باستخدام بادئات التي تحتوي على تسلسل عبارة B ATT تهجيني. هو معاد لأول مرة [كدنا] تضخيم في pDONR201 المانحة لإنشاء ناقلات ناقلات دخول ثم تحولت إلى E. القولونية سلالة DH5a. بعد اختيار recombinants ناجحة وصغيرة من الحمض النووي الإعدادية العزلة ، هو معاد للناقلات دخول ناقلات الوجهة التي تحتوي على مروج لإنشاء التعبير البلازميد. تفاصيل حول الاستنساخ تهجيني تتوفر إما من دليل أو في عبارة Invitrogen كالدويل وآخرون 5. </li></ol></li></ol> اختيار ماركر البلازميد أمثلة على البلازميدات علامة المعدلة وراثيا تشمل رول - 6 أو استخدام العضلات المروج الجسم الجدار UNC - 54 إلى محرك الفلورسنت بروتين تعبير. هذه علامة البلازميدات عادة ما تكون متاحة من داخل الأوساط البحثية عند الطلب. Microinjection من ايليجانس جيم إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء العزلة الحمض النووي للالبلازميدات اللذين يتم ليتم حقنه. Quantitate منهم وتخلط معا في نسبة 1:1 من كل نانوغرام / 50 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد منصات أجار : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الحل agarose 2 ٪ في الماء ، الحرارة أو الميكروويف حتى المنحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المبينة عدة تغطي 22 × 50 مم النظارات على الفوق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة باستور ، ضع نقطة من agarose ذاب على الزجاج غطاء واحد ومكان على الفور الزجاج غطاء الثاني على الهبوط بزاوية 90 إلى الأول. تكرار للعديد من النظارات تغطية أخرى. ينبغي أن قطر القرص بالارض من agarose يكون بين 15-20 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد agarose وقد عززت (وهذا يستغرق سوى لحظات) ، وإزالة غطاء زجاجي ، والسماح للسادة في الهواء الجاف تماما (عدة ساعات ليلة وضحاها). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين منصات في غطاء صندوق زجاجي في درجة حرارة الغرفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل إبرة لوادر حل الحمض النووي : يتم إنشاؤها لوادر إبرة من الأنابيب الشعرية 100 ميكرولتر التي يتم تسخينها في وسط أكثر من اللهب المكشوف وانسحبت بسرعة لمدة ما يقرب من مرتين. وقطعت شطري عدا مرة واحدة في الأنابيب الشعرية يبرد. مخزون وادر إبرة للحقن 10-20. مخزن تستقيم في microcentrifuge الرف الأنبوب. توخي الحذر حتى لا أسعد نفسه على نقطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الإبر microinjection : يرصد الإبرة من أنبوب الشعرية الخاصة التي تحتوي على خيوط الزجاج الداخلية ، وهذه الخيوط هي بمثابة الفتيل من أجل حل الحمض النووي. يتم سحب هذه على جهاز إبرة مجتذب. نستخدم PP - 830 Narishige مجتذب مع إعداد الحرارة 24.8. يتم سحب الإبر عدة في وقت واحد ويتم تخزينها في مربع صغير من البلاستيك. ويمكن بسهولة متعددة الإبر &quot;منصة&quot; على شريط من الطين النمذجة للتخزين الطويل الأجل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبرة غيض &quot;الخارجين&quot; : يتم سحبها رأس الإبرة microinjection الغرامة بحيث يتم مغلقة فعليا عند نهاية وأنه ينبغي كسر المفتوحة باستخدام شظايا صغيرة من الزجاج غطاء. وتعد هذه الاشارات من 18 X 18 مم غطاء زجاجي في منشفة ورقية وتطبيق الضغط برفق حتى تقطع إلى عدة قطع. شظايا من حجم مفيدة ما يقرب من 3 × 4 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو البرية نوع (N2) الديدان إلى مرحلة الكبار في وقت مبكر عن طريق الحقن باستخدام الاجراءات القياسية 6. تعد نحو 100 نظموا صحيح الديدان / بناء حقن. </li></ol> إجراء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح صمام الرئيسي على دبابة الهيليوم التي متصلة microinjection ذراع وحامل إبرة. إغلاق صمام منظم للسماح للغاز للدخول على الخط ، ليصل الضغط إلى 35 رطل في البوصة المربعة. إشعار التي يمكن أن يتم الافراج عن الغاز باستخدام دواسة القدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضافة الى وجود رافعة إبرة في الفم أنابيب pipetter القياسية (وجدت في حاوية من أنابيب الزجاج الشعرية) ووضع كمية صغيرة من الخليط البلازميد (~ 1 ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضعت بعناية لودر إبرة في نهاية الجزء الخلفي من إبرة الحقن ، وإدراج بلطف على طول الطريق من خلال طولويرى الإبرة حتى المقاومة. طرد حل الحمض النووي التي تهب بلطف ، ثم إزالة المحمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال الإبرة في ذراعه microinjection ، والحرص على وضعه داخل طوقا المطاط الداخلية الصغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كسرة إبرة كسر الزجاج غطاء على أحد حافة منصة آغار. تغطي قشرة ، وكذلك على سطح لوحة كاملة من آغار ، مع الهالوكربون النفط. مكان لوحة أغار على مرحلة مجهر مقلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الإبرة في وسط الميدان عرض باستخدام الهدف 4X وساطعة الإضاءة الميدان ، ولكن لا أقل إلا أنها في النفط. أيضا ، موقف الحافة الداخلية للقشرة من الزجاج تغطي في الوسط ، ثم التركيز على أنه (لا تزال تستخدم الهدف 4X). انخفاض الإبرة في النفط ، مما جعلها الطائرة التنسيق نفس كسرة من الزجاج غطاء. رفع التكبير عن طريق التحول إلى هدف 40X. إعادة التركيز على حافة قشرة وإعادة رأس الإبرة ، إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفتح رأس الإبرة الحقن ، ودفع الإبرة برفق على حافة الغطاء كسرة الزجاج ، بينما في الوقت نفسه تطبيق نبضة قصيرة من الغاز عن طريق دواسة القدم. وسيتم الإبرة مكسورة بما فيه الكفاية عندما فتح قطرات صغيرة من السائل الهروب نهاية الإبرة. تدفق السوائل الزائدة بسبب فتح كبيرة جدا غير مرغوب فيه ، لأنها سوف تقتل الحيوانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة آغار من مرحلة عن طريق رفع الإبرة ، ولكن لا تغير في موقف أو X - Y - المحور. الشريحة المرحلة من تحت الإبرة ، وإزالة لوحة آغار ووضعه على مجهر تشريح. نقل دودة كي تستقر على الوسادة ، تحت سطح الزيت. إذا التواءات دودة ، والسكتة الدماغية برفق حتى اتصالات لوحة آغار. وينبغي أن الدودة رطبة التمسك agarose الجافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان بسرعة خلف منصة أغار على خشبة المسرح ، وتركزت الدودة في مجال الرؤية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انخفاض الإبرة في نفس الطائرة من التركيز على الدودة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل المرشحات لالإضاءة هوفمان (نوع من تصفية التباين). وهذا يسمح بالتفصيل المورفولوجية من الدودة لتصبح مرئية. إذا Nomarski / مدينة دبي للإنترنت بصريات متاحة على نطاق مقلوب التي ستعمل كذلك. الهدف باستخدام 40X ، والتركيز على مركز &quot;محببة&quot; المخلوي في الغدد التناسلية دودة ، تحت نمط &quot;العسل&quot; من نوى الجرثومية (اختر أيهما التناسلية يتوضع على الجانب من الدودة التي تواجه الإبرة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صقل موقف الإبرة حتى التلميح أيضا في التركيز (الطائرة ذاتها في &quot;التحبب&quot; الغدد التناسلية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج بلطف الإبرة في وسط الغدد التناسلية وتطبيق نبضة قصيرة من ضغط الغاز لطرد قطرة أو اثنتين من الحمض النووي في الذراع الغدد التناسلية. يجب أن نلاحظ انتشار موجة من السائل عبر الغدد التناسلية القاصي. لا تتحمل المزيد من السائل هو أفضل ، لأن الكثير من السوائل يمكن أن تتدفق إلى ثني ذراع القريبة من الغدد التناسلية ، والتي يمكن إيقاف إنتاج البويضة. إذا كان ذلك ممكنا ، تبعا للموقف من الدودة ، وضخ الذراع التناسلية الأخرى بنفس الطريقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من المهم العمل بسرعة في حين حقن الدودة ، لأنها يمكن أن يجفف بسهولة. قرار لحقن ذراع التناسلية الثاني يعتمد على مدى السرعة التي يمكن إعادة وضع الإبرة ودودة. ينبغي أن تأخذ العملية برمتها بشكل مثالي أقل من 1-2 دقائق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الزجاج غطاء من مرحلة وضعها على نطاق تشريح. تطبيق 1μl العازلة من M9 (22mm و KH 2 PO 4 ، 42mM نا 2 هبو 4 ، 85mm و كلوريد الصوديوم ، 1MM MgSO 4) مباشرة على دودة حقن (وهذا قد يستتبع غمر غيض ماصة تحت السطح من النفط الهالوكربون). يجب ترطيب المنطقة العازلة الدودة ، وسوف تطفو على السطح ثم قبالة منصة agarose. نقل الدودة إلى لوحة العادية باستخدام التقاط الدودة. ويمكن إعادة استخدام لوحة agarose عدة مرات أكثر حتى أنها أصبحت مشبعة جدا مع عازلة والديدان لم تعد تلتزم. </li></ol> اختيار المعدلة وراثيا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقل حقن الديدان ، و0 ف جيل ، لوحات فردية ، طازجة المصنف البكتريا (60 ملم) والسماح لها بالتكاثر. عادة ، يتم حقن الحيوانات المحتضنة في 20 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام حتى تظهر ذرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويلاحظ أن F 1 ذرية للحصول على أدلة من علامة المعدلة وراثيا (مثل مضان) باستخدام stereomicroscope الفلورسنت. كل الفلورسنت ، الناقل F 1 ، يتم استنساخ الحيوانات بشكل منفصل على لوحة جديدة (منذ تعتبر النسل من كل F 1 خطا متميزا). يسمح للF 1 المخنثين على الإنجاب. مرة أخرى ، وعادة ما يتم تنفيذ ذلك في عند 20 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام حتى تظهر ذرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويلاحظ في 2 F توليد للحيوانات معدلة وراثيا كذلك. تعتبر F 2 الحيوانات التي ورثت وأعرب عن مجموعة معدلة وراثيا &quot;مستقرة&quot; الخط. ملاحظة : في الحادي و1 واوالعمر قد يكون هناك العديد من الحيوانات المحورة وراثيا ، لكنها ليست مستقرة. فإن الغالبية العظمى من الحيوانات المعدلة وراثيا F 1 لا يمكن نشرها في F 2 خطوط مستقرة. ملاحظة : للسيطرة على التغير في الجين في عدد النسخ ، وتوليد ما لا يقل عن ثلاثة خطوط مستقرة ومستقلة في بناء حقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي الحفاظ على كل سطر مستقل ومستقر كخط منفصلة من الديدان. ويمكن نشر كل سطر من خلال نقل الحيوانات المعدلة وراثيا عدة لوحة جديدة في كل جيل ، ويجب أن يتم تنفيذ هذا باستخدام stereomicroscope الفلورسنت إذا هو علامة اختيار الفلورسنت. </li></ol>

<ol>
	<li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans.">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+requirements+for+somatic+and+germline+expression+of+a+generally+expressed+Caenorhabditis+elegans+gene.">Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene.</a> Genetics. 146, 227-238 (1997).</li><li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans.">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li><li>Caldwell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li></ol>

عند القيام بهذا الإجراء ، فإنه من المهم أن نتذكر أن : -- حقن مباشرة في مركز الغدد التناسلية -- لا حقن السائل الكثير -- العمل بسرعة لمنع أصاب. إذا واجهت مشاكل مع الإبرة ، مثل كسره كبيرة جدا ، فمن الأفضل لإعادة إبرة جديدة ، بدلا من محاولة لحقن مع أقل...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Ultrapure</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Halocarbon Oil, Voltalef</td>
<td>Hulle 10S</td>
<td>elfatochem, France</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 18x18 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-548-A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 20x30 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-548-5A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 22x50 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-545-E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 ul Capillary</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>53432-921</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillary for Needles</td>
<td>"Kwik-Fil"</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>1B100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Puller</td>
<td>Tool</td>
<td>Narishige</td>
<td>Model PP-830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microINJECTOR System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tritech Research</td>
<td>MINJ-1000</td>
<td>Scope, Stage, Manipulator</td>
</tr>
<tr>
<td>Dissecting, with Fluorescence</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ645</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

generation of stable transgenic c. elegans using microinjection

يمكن أن يكون وراثيا ايليجانس انواع معينة بسهولة عن طريق إنشاء microinjection حل DNA البلازميد في 1 التناسلية. ال DNA البلازميد يتشكل من جديد إلى النموذج concatamers خارج الصبغي التي ورثت ستابلي ، وإن لم يكن بنفس الكفاءة كما الكروموسومات الفعلي 2. والمورثة ذات الاهتمام المشترك مع حقن علامة an المظهري واضحة ، مثل رول أو GFP - 6 ، للسماح للاختيار من الحيوانات المعدلة وراثيا تحت المجهر تشريح. ويمكن التعبير عن هذا الجين الخارجية من المروج الأصلي للدراسات توطين الخلوية. بدلا من ذلك ، يمكن أن تكون مدفوعة من قبل التحوير المروج مختلف الأنسجة محددة لتقييم دور الجينات في منتج معين أو تلك الخلية الأنسجة. هذه التقنية محركات بكفاءة التعبير الجيني في جميع أنسجة ايليجانس جيم باستثناء الجنين أو أوائل germline 3. ويستخدم على نطاق واسع من الحيوانات المعدلة وراثيا إنشاء لمجموعة من النماذج التجريبية. هذا الفيديو يوضح الإجراء microinjection لتوليد الديدان المعدلة وراثيا. وعلاوة على ذلك ، وصفت اختيار وصيانة خطوط مستقرة جينيا ايليجانس جيم.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection at JoVE.com

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

هذا الفيديو يوضح أسلوب microinjection في الغدد التناسلية من ايليجانس جيم لخلق حيوانات معدلة وراثيا.

توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

generation-of-stable-transgenic-c-elegans-using-microinjection

Research

JoVE Journal

Biology

52.6K Views.  University of Alabama. هذا الفيديو يوضح أسلوب microinjection في الغدد التناسلية من ايليجانس جيم لخلق حيوانات معدلة وراثيا.

Video: Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjection الجنين بعوض ألف الحصول على البعوض المعدلة وراثيا

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

جيل المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق تحويل Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

التصوير C. ايليجانس الأجنة باستخدام مجهر Epifluorescent وبرمجيات المصدر المفتوح

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

تفعيل موت الخلايا المبرمج من قبل Microinjection هيولي من السيتوكروم ج</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

تحديد ملامح التعبير الجيني في C. ايليجانس استخدام ميكروأري وPCR الوقت الحقيقي

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. ايليجانس الانجذاب الكيميائي الفحص

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

تلوين الأجسام المضادة في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; عن طريق &quot;تجميد تكسير&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

قياس آثار البكتيريا على<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; السلوك باستخدام مقايسة الاحتفاظ البيض

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

جيل المعدلة وراثيا<em&gt; حيدرة</em&gt; من جانب الأجنة حقن مكروي

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

التحقيق في نشر وسمية البروتينات مثل بريون باستخدام Metazoan نموذج حي<em&gt; C. ايليجانس</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...