미세 주입을 사용하여 DNA 구축물을 Strongyloides에 전달하면 녹아웃 및 트랜스제닉을 생성 할 수 있습니다.이 웜이 어떻게 발달하고, 환경을 탐색하고, 숙주를 기생시키는 지 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 지금까지, 이것은 이러한 기생충에서 녹아웃 및 트랜스제닉을 생성하는 유일한 성공적인 기술입니다. 미세주입 하루 전, 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 커버 슬립에 아가로스 용액 180 마이크로리터를 넣은 다음, 즉시 두 번째 커버 슬립을 위에 떨어뜨려 아가로스를 얇은 패드로 평평하게 만듭니다.
5 ~ 10 초 후, 두 개를 밀어 상단 덮개 슬립을 제거하고 한천 패드가 어느 슬라이드에 있는지 확인한 다음 위로 향하게하십시오. 그런 다음 깨진 커버 슬립에서 작은 유리 파편을 선택하고 집게를 사용하여 패드의 상단 가장자리 근처의 한천으로 부드럽게 누릅니다. 미세 주입 당일, Baermann 홀더를 줄 지어 놓으십시오.이 체는 두 개의 플라스틱 링으로 만든 체로 나일론 튜일 그물망 두 층이 세 개의 겹치는 실험실 조직 조각으로 그 사이에 고정되어 있습니다.
그런 다음 배설물 - 숯 혼합물을 Baermann 홀더에 첨가하십시오. 다음으로 깔때기에 분변 - 숯 혼합물이있는 Baermann 홀더를 놓고 분변 - 숯 혼합물 주위에 조직 조각을 접은 다음 분변 숯의 대부분을 잠수하기에 충분한 물을 첨가하십시오. 그런 다음 깔때기를 15 센티미터 플라스틱 페트리 접시 뚜껑으로 올려 냄새를 억제하고 필요에 따라 깔때기에 라벨을 붙입니다.
한 두 시간 후, 깔때기 바닥의 고무 튜브 아래에 50 밀리리터 원심 분리 튜브를 잡고 조심스럽게 하단의 클램프를 열어 웜이 들어있는 30 ~ 40 밀리리터의 물을 50 밀리리터 튜브에 분배하십시오. 그러면. 웜이 들어있는 Baermann 물 15 밀리리터를 15 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 돌리고 상청액을 최대 13 밀리리터까지 제거한 다음 요오드가 함유 된 액체 폐기물 용기에 버려 웜을 죽입니다.
모든 웜을 수집 한 후 튜브 바닥에있는 웜 펠렛을 검사하십시오. 웜이 보이지 않으면 한 두 시간 동안 기다린 다음 Baermann 장치에서 더 많은 웜을 수집하십시오. E.coli HB101의 잔디밭이있는 6 센티미터 2 % 선충류 성장 배지 플레이트에 가능한 한 적은 물에 웜을 옮기고이 플레이트를 미세 주입을위한 소스 플레이트로 사용하십시오.
해부 현미경 아래, 표준 백금 웜 픽을 사용하여 마이크로 주입 패드 커버 슬립의 유리 파편을 할로 카본 오일로 덮으십시오. 그런 다음 미세 주입 패드 커버 슬립을 미세 주입 범위에 놓고 오일로 덮인 유리 파편을 찾습니다. 가장자리가 바늘의 방향에 수직이 되도록 유리 파편을 정렬하여 바늘을 부러 뜨리는 데 사용되는 표면 역할을합니다.
다음으로, 해부 현미경을 사용하여 바늘에 테이퍼 샤프트에 기포 나 이물질이 없는지 확인한 다음 바늘을 가압 홀더에 1 ~ 1.5 센티미터 고정하십시오. 바늘의 끝을 눈으로 볼 수 있는 현미경의 중앙에 놓고 저배율 하에서 바늘의 끝을 유리 파편의 측면에 수직인 시야각에 위치시킵니다. 그런 다음 더 높은 배율로 전환하고 바늘 끝을 유리의 가장자리에 맞 춥니 다. 가까이에서 만지지는 않습니다.
다음으로, 바늘의 팁을 부수고 액체 흐름을 허용하려면 가스로부터 지속적인 압력을 가하면서 유리 조각의 측면에있는 바늘을 부드럽게 누릅니다. 액체가 흐르기 시작하면 팁의 모양을 확인하고 쉽게 흐르는 액체로 날카로운지 확인하십시오. 액체가 바늘에서 잘 흐르면 미세 주입 슬라이드를 해부 범위로 옮기고 웜을 배치하기 위해 한천 패드에 하나 ~ 두 마이크로 리터의 할로 카본 오일을 추가하십시오.
20 ~ 30 명의 젊은 성인 스트롱 틸로이드를 박테리아가없는 2 % 선충류 성장 배지 플레이트에 적어도 5 분 동안 옮겨 과도한 표면 박테리아를 제거하고 미세 주입을위한 단일 웜을 선택하십시오. 주입하는 동안 필요에 따라 플레이트에 더 많은 웜을 추가하십시오. 웜 픽에 소량의 할로 카본 오일을 사용하여 박테리아가없는 접시에서 생식선에 하나 ~ 네 개의 알을 가진 Strongyloides 젊은 성인 여성을 선택하고 웜을 한천 패드의 작은 기름 방울로 옮깁니다.
웜 픽을 사용하여 웜이 감겨지지 않도록 부드럽게 배치하고 생식선이 보이고 접근하기 쉽습니다. 그런 다음 미세 주입 현미경 시야에 웜을 배치하여 생식선이 바늘과 같은면에 있는지 확인하고 바늘이 약간의 각도로 생식선에 닿을 수 있도록 배치하십시오. 다음으로, 바늘의 끝을 동일한 초점면의 웜 옆으로 가져 오십시오.
그런 다음 웜의 중간 근처의 생식선 팔을 겨냥하여 미세 인젝터를 사용하여 바늘을 생식선에 부드럽게 삽입하십시오. 즉시 바늘에 압력을 가하여 전체 생식선 팔을 DNA 용액으로 부드럽게 채 웁니다. 충분한 유체가 주입 된 후 바늘을 제거하고 상처가 닫히는 것을 관찰하십시오.
생식선의 다른 팔이 보이면 절차를 반복하십시오. 주사가 완료되면 한천 패드에 바늘 끝으로 압력을 가하여 바늘이 막히지 않았는지 신속하게 확인한 다음 주입 된 웜으로 슬라이드를 해부 현미경으로 옮깁니다. 주입 된 웜을 복구하려면 먼저 웜에 웜 완충 식염수 몇 방울을 떨어 뜨려 한천 패드에서 떼어냅니다.
그런 다음 웜 픽에 소량의 박테리아를 모으고 부착 박테리아로 웜을 만져서 액체에서 제거하십시오. 웜을 복구 플레이트로 부드럽게 옮깁니다. 행동 실험을 위해, 20 내지 30마리의 유충을 두꺼운 HB101 박테리아 잔디밭이 있는 2%선충 성장 배지 플레이트로 옮기고, 형광 해부 현미경 하에서 관심있는 전이유전자를 발현하는 유충을 확인한다.
그런 다음 웜 픽을 사용하여 형질전환 유충을 선택하고 웜 완충 식염수가있는 작은 시계 유리에 놓습니다. 현미경 검사의 경우, 면도날을 사용하여 10 센티미터 화학주성 플레이트의 플라스틱 바닥에 그리드를 채점하여 플레이트에서 웜의 위치를 쉽게 추적하십시오. 다음으로, 웜 버퍼링 식염수에 세 마이크로 리터의 유충을 그리드의 사각형에 넣고 필요한만큼 많은 사각형을 채 웁니다.
그런 다음 웜 방울에 물에 1 % 니코틴 15 ~ 20 마이크로 리터 방울을 넣으십시오. 네 분 후, 웜이 마비되면 형광 해부 현미경을 사용하여 웜을 스크리닝합니다. 불완전하고 완전한 act-2 mRFPmars 발현 패턴을 갖는 트랜스제닉 스트롱실로이드 스테로이드 유충이 여기에 제시되어 있다.
체벽 근육에서의 패치 발현은 전이유전자가 게놈에 통합되지 않을 때 더 흔하다. 대조적으로, 체벽 근육 전체에 걸친 일관된 발현은 종종 전이유전자가 게놈 내로 통합되었다는 것을 나타낸다. 핵심 단계는 DNA가 생식선에 주입되고 발달하는 알에 통합 될 수 있도록 생식선과 동일한 초점 평면에 바늘을 배치하는 것입니다.
이 기술의 개발은 기생충 선충류의 유전자 기능을 연구 할 수있게 해주었고, 기생충과 숙주 - 기생충 상호 작용의 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 있습니다.
